霉菌和酵母菌快速測試技術與國家標準方法在食品檢測中的應用比對

張 絨，李慧芳，陳炎歡，陳仲婷

（無限極（中國）有限公司，廣東江門 529100）

霉菌和酵母菌在自然界廣泛存在，受霉菌污染的食品對人體造成的危害不容小覷，輕則中毒、重則致癌、致畸、致突變。酵母菌作為一種發酵菌，可將食物中的糖發酵，易致使食品腐敗變質，對人體造成不同程度的傷害。因此，霉菌和酵母菌檢測項目常被作為食品加工企業評價食品安全的重要指標。

食品中霉菌和酵母菌計數檢驗主要依據《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》（GB 4789.15—2016）[1]，但該方法的檢測周期長，從樣品準備到出具報告至少需要6 d，而快速測試片檢測過程僅需3 d。霉菌和酵母菌快速測試片（以下簡稱快速測試片法）是一種預先制備好的一次性培養基制品，含有微生物生長所需的營養物質及顯色劑，具有操作簡便、便于運輸、成本低等優點[2]。但由于快速測試片還不是我國食品微生物檢驗的國家標準方法，所以現階段無法在檢測機構和食品企業中大規模應用。

本研究將日常工作中的兩款原料進行人工污染并作為試驗樣品，分別添加白色念珠菌、黑曲霉兩個標準菌株，采用霉菌和酵母菌快速測試片法和GB 4789.15—2016對兩種試驗樣品進行測定，通過開展快速測試片法的重復性試驗、差異比較試驗，確認快速測試片法是否與國標方法存在顯著差異，為快速測試片法作為原料日常監控霉菌和酵母菌的檢測方法提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

酪蛋白磷酸肽（廣州市銳力發展有限公司）；碳酸鈣（廣東大地食用化工有限公司）。

1.1.2 培養基及菌種

3M PetrifilmTM霉菌和酵母菌檢驗快速測試片（3M公司）；孟加拉紅培養基（廣東環凱微生物科技有限公司）；白色念珠菌（ATCC 10231）、黑曲霉（ATCC 16404），均來源于廣東省微生物菌種保藏中心（國家專利菌種保藏平臺）。

1.1.3 設備

超凈工作臺；生物安全柜；霉菌培養箱；恒溫水浴箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株適用性試驗

樣品制備：按照GB 4789.15—2016方法，在25 g樣品中加入225 mL稀釋液，充分溶解，混合均勻。

試驗菌株制備：將試驗菌株白色念珠菌（ATCC 10231）、黑曲霉（ATCC 16404）復蘇后，制成一定濃度的菌懸液。

供試液制備：將一定濃度的試驗菌株白色念珠菌（ATCC 10231）、黑曲霉（ATCC 16404）制成的菌懸液加入樣品中，使每1 mL樣液中含菌量為10～150 CFU。

國家標準GB 4789.15—2016測試方法：按上述方法進行樣品制備后，吸取1 mL待測樣液于平皿內，傾注孟加拉紅瓊脂，置于（28±1）℃培養5 d，觀察結果。

菌株適用性試驗方法：為確認樣品中的微生物能被充分檢出，先選擇最低稀釋級的樣液進行計數方法適用性試驗。加菌液的體積不超過供試液體積的1%，依照GB 4789.15—2016方法開展檢測，培養后觀察結果，驗證樣品對試驗菌株是否有生長抑制性。

1.2.2 試驗樣品重復性試驗

將一定濃度的試驗菌懸液加入通過菌株適用性試驗的樣品中，制成終濃度為10～150 CFU·mL-1的加標樣品。

快速測試片法：按產品使用操作說明，取1 mL待測樣品置于快速測試片中，置于（28±1）℃培養48 h后，觀察結果。

重復性分析方法：用快速測試片法對加標樣品進行霉菌和酵母的檢測，每個樣品由同一操作者使用同一設備在短時間內進行兩次獨立的單次試驗，參照《食品和動物飼料微生物學30 ℃菌落計數方法》（SN/T 1800—2006）[3]中重復性要求進行快速測試片法試驗結果分析，兩次獨立的單次試驗結果對數的絕對差值不應大于重復性限0.25（即r≤0.25）。

1.2.3 試驗樣品顯著性差異比較試驗

將試驗菌株白色念珠菌（ATCC 10231）、黑曲霉（ATCC 16404）制成高中低5種濃度的菌懸液，加入待測樣品中采用快速測試片法和國家標準法同時進行檢測[4]。通過Minitab 15對試驗數據進行t檢驗統計分析，若t檢驗統計量的概率P＜0.05，認為快速測試片法和國家標準法有顯著差異；P＞0.05，則認為快速測試片法和國家標準法無顯著差異。

2 結果與分析

2.1 菌株適用性試驗結果

由表1、表2可知，對添加白色念珠菌（ATCC 10231）、黑曲霉（ATCC 16404）的兩種樣品按照GB 4789.15—2016開展檢測后，結果表明霉菌和酵母菌在試驗樣品中生長良好，回收PR值在0.5～2.0，兩種樣品酪蛋白磷酸肽、碳酸鈣對所測試菌株無生長抑制性。

表1 酪蛋白磷酸肽菌株適用性試驗結果

表2 碳酸鈣菌株適用性試驗結果

2.2 試驗樣品重復性試驗結果

由表3、表4可知，用快速測試片法進行霉菌和酵母菌測試，參照《食品和動物飼料微生物學30 ℃菌落計數方法》（SN/T 1800—2006）中重復性要求進行數據分析。結果表明，酪蛋白磷酸肽和碳酸鈣樣品采用快速測試片法的兩次測試結果r值均＜0.25，重復性結果可接受。

表3 酪蛋白磷酸肽重復性測試結果

表4 碳酸鈣重復性測試結果

2.3 試驗樣品顯著性差異比較試驗結果

由表5、表6可知，用快速測試片和國家標準法分別對添加菌液的樣品進行霉菌和酵母計數檢測，t檢驗分析后表明，酪蛋白磷酸肽中，霉菌t=1.55，P=0.132（P＞0.05），酵母菌t=0.03，P=0.974（P＞0.05）；碳酸鈣中，霉菌t=0.14，P=0.888（P＞0.05），酵母菌t=-0.01，P=0.989（P＞0.05）。結果表明，酪蛋白磷酸肽和碳酸鈣兩組樣品采用國家標準法和快速法測試的霉菌和酵母菌檢測結果均無顯著差異（P＞0.05）。

表5 酪蛋白磷酸肽顯著性差異比較測試結果

表6 碳酸鈣顯著性差異比較測試結果

3 結論與探討

通過Minitab 15對霉菌和酵母菌快速測試片法與《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》（GB 4789.15—2016）方法的試驗數據進行t檢驗統計分析，結果顯示快速測試片法與國標方法相比無顯著性差異（P＞0.05）。霉菌和酵母菌快速測試片易于操作，無需其他輔助器具即可快速檢測樣品，能有效縮短檢測周期，達到快速評估的目的，同時該方法也得到美國分析化學家協會（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）的認可。

重復性試驗結果參照《食品和動物飼料微生物學30 ℃菌落計數方法》（SN/T 1800—2006）中重復性要求對快速測試片法檢測霉菌和酵母的試驗結果進行分析，試驗結果在要求范圍。但由于重復性限的范圍（r≤0.25）較寬，對數據的要求不嚴格，在實際檢測過程中，建議根據情況采取等效的、更嚴格的控制方法和標準進行仲裁判定，確保風險得到有效控制[5]。

本試驗所用酵母和霉菌測試片，其培養基含有作為載體的冷水可溶性凝膠和對霉菌和酵母敏感的指示劑（5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽），與酵母、霉菌在培養生長過程中發生特異性顯色反應，通過生長特征和顏色變化來判定霉菌和酵母的種類和數量[6]。其中酵母菌為藍綠色，較小菌落，筆者在其他物料的檢測過程中發現其中的小型顆粒比較容易在檢測過程中被染色，對結果判讀造成干擾，建議對于需要用快速測試片法進行檢測的機構或企業，在使用前應針對每一種物料進行適用性驗證，以確保檢測結果的準確性。