環境壓力對益生菌沖劑活性的影響

莫景康，黎紹基

（廣州工商學院，廣東廣州 510000）

益生菌是指寄生在人體內，與人體形成共生關系并對人體健康有利的微生物。常見的益生菌有乳桿菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌以及球菌等[1]。益生菌能在宿主腸道內定植并產生乳酸、細菌素和過氧化氫等物質，抑制腸道內的有害微生物，促進宿主腸道健康。目前，它們被廣泛應用于食品和醫藥領域[2-3]。

益生菌在食品生產過程中和進入消化道后都可能經歷各種環境壓力，因此良好的環境壓力耐受性對益生菌至關重要。靳志強等[4]采用MRS培養基模擬胃酸環境以及膽鹽環境，分離提取出一種可以承受pH=3的環境以及膽鹽濃度為0.3%的環境的植物乳桿菌。李利等[5]從酸奶中分離出的2株乳桿菌具有優良的抗酸性以及抗膽鹽能力。李一娟等[6]發現從健康家禽新鮮糞便中分離出來的羅伊氏乳桿菌在經過 pH=2.5、1.5 g·L-1膽鹽以及 1 mmol·L-1H2O2接種處理6 h后，活菌數基本能維持初始濃度。

為了解市面上的益生菌沖劑所含的益生菌在不同環境壓力下的活性，本研究以市場上在售的3種益生菌沖劑產品為研究對象，檢驗其中的益生菌對酸、膽鹽以及抗氧化性壓力的耐受性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

將有效期內的3種益生菌沖劑產品（表1）接種于MRS液體培養基中，于37 ℃培養活化，每24 h傳代。實驗時將OD在0.5～1.0的3種細菌培養液在4 000 r·min-1離心10 min，離心后去掉上清液，用生理鹽水懸浮，重復以上離心、懸浮、離心，然后將菌體懸浮于新鮮的MRS液體培養基中，使OD≈1.0待用。

表1 實驗用益生菌沖劑信息

MRS固體培養基和豬膽鹽購自北京奧博星生物技術有限公司，過氧化氫溶液購自廈門安永博科技有限公司，MRS液體培養基購自杭州百思生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 對環境壓力條件篩選

借鑒袁琨等[7]實驗方法，將OD≈1.0的3種產品的益生菌用膽鹽、酸和過氧化氫處理，具體濃度如下，每個處理重復3次。A：膽鹽濃度0%、0.1%、0.2%、0.3%和0.4%（w/v）；B：pH值為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和6.5；C：H2O2濃度0%、0.003 3%、0.006 7%、0.010 0%、0.0133%（v/v）；37 ℃恒溫培養12 h，測量3種益生菌產品在600 nm的OD值。

1.2.2 環境壓力耐受能力測定

借鑒袁琨等[7]實驗方法，將OD=0.5～1.0的3種產品培養液按上述方法清洗并懸浮于MRS中，使OD≈1.0，立刻對菌液進行以下4種處理，每個處理重復3次。A：0.3%膽鹽作為膽鹽壓力；B：pH值為2作為酸性壓力；C：0.01% H2O2作為氧化壓力；D：無壓力的對照。菌液在37 ℃培養，在第4 h、8 h、12 h、24 h和48 h測OD。以時間為橫坐標，以OD為縱坐標作各壓力組和對照組的生長曲線。

2 結果與分析

2.1 無環境壓力下生長情況

由圖1知，在無壓力環境中，A、C產品益生菌在24 h時菌落達到穩定期并持續到48 h。而B產品益生菌在24 h時正處于穩定期，在48 h時進入衰亡期。

圖1 3種益生菌沖劑內所含益生菌在無環境壓力下的生長情況

2.2 耐膽鹽能力

在12 h內，3種產品對不同膽鹽濃度的適應能力都較強，在0.4%膽鹽濃度下3種產品都能成功繁殖生長。其中在0.1%膽鹽濃度下A、C產品益生菌耐受能力優于無膽鹽對照組，在0.4%膽鹽濃度下B產品益生菌耐受能力優于無膽鹽組（圖2）。依據此結果，選取0.3%膽鹽濃度用于動態活性研究。

圖2 3種益生菌沖劑內所含益生菌在不同膽鹽濃度的活性

3種產品在0.3%膽鹽濃度下培養48 h的動態活性如圖3所示。3種產品在4 h測定時菌落總數已經達到頂峰，往后開始進入衰亡期。與無壓力對照組相比可以看出，0.3%濃度膽鹽對3種產品的菌株都具有較強的促進生長能力。

圖3 膽鹽濃度為0.3%時3種益生菌沖劑內所含益生菌的生長情況

2.3 耐酸能力

在pH值為1.5～3.0培養12 h時，3種產品的益生菌均處于抑制狀態，而在pH值為3.5時A、C產品益生菌能進行少量繁殖且C產品益生菌比A產品益生菌繁殖稍強，而B產品益生菌仍被抑制，無法繁殖。說明A、C產品益生菌的耐酸能力比B產品好（圖4）。依據此結果，選取pH=2.0用于動態活性研究。

圖4 3種益生菌產品內所含益生菌在不同pH值下的實驗結果

在pH值為2.0下，在培養的48 h內，A、B產品益生菌被全程抑制，C產品益生菌能進行少量繁殖。說明在胃酸強度的pH下（pH=2.0），3種產品益生菌的耐受能力一般（圖5）。

圖5 pH=2.0時3種益生菌沖劑所含益生菌的生長情況

2.4 抗氧化能力

在H2O2濃度為0.003 3%時培養12 h，對3種產品的益生菌抑制作用不明顯，H2O2濃度高于0.006 7%時，3種產品益生菌生長受限。可以說明3種益生菌具有一定的抗氧化能力（圖6）。依據此結果，選取0.010 0% H2O2濃度用于動態活性研究。

圖6 3種益生菌沖劑所含益生菌在不同H2O2濃度下的生長情況

在0.010 0% H2O2中的動態生長情況如圖7所示。3種益生菌沖劑所含益生菌在0.010 0%固定濃度的H2O2中培養48 h，A、B產品的益生菌全程被抑制，無生長。而C產品益生菌在48 h監測時，發現成功繁殖并達到最高菌落濃度。

圖7 3種益生菌沖劑所含益生菌在0.010 0% H2O2中的生長情況

3 結論

3種益生菌產品在膽鹽濃度為0.1%、0.2%、0.3%和0.4%下均能保持活性，且A和C產品在0.1%的濃度下出現益生菌生長速度超過無壓力對照組的情況，說明低濃度膽鹽能促進部分益生菌產品的生長繁殖。在pH值低于3.5時，3種產品的益生菌生長活性受限，無法大量繁殖，說明3種益生菌產品耐酸性一般。使用低濃度的H2O2處理后，發現3種益生菌在低濃度的H2O2（0.003 3%）濃度下能進行生長繁殖，可以說明3種益生菌產品都有一定的抗氧化性能。如何提高產品益生菌的耐消化活性，是各個廠家研發人員需要重點解決的問題。對益生菌沖劑產品的探究，能為市場監管部門提供數據支撐，幫助研發人員更好地開發該類產品。