蠟樣芽孢桿菌的檢測分析

韓珍珍

（運城市綜合檢驗檢測中心，山西運城 044000）

由微生物引起的一系列食源性疾病是世界范圍內日益嚴重的公共衛生問題之一[1]。我國每年由微生物導致的食物中毒占全部食源性疾病的50%左右[2-4]。其中，由蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）引發的食物中毒問題越來越受到人們的關注。該菌為兼性厭氧的桿狀革蘭氏陽性菌，為芽孢桿菌科蠟樣芽孢桿菌屬，廣泛存在于空氣、水體、土壤等環境中，為植物和動物的主要污染源，因此無法避免地會污染到食品[5]。少量蠟樣芽孢桿菌不會引起食物中毒，但當被蠟樣芽孢桿菌污染的食物加熱不徹底，其會在食物中呈指數生長產生腸毒素，危害人體健康[6]。一般認為蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒屬毒素型食物中毒。據國內外報道，幾乎所有種類的食品中都有檢測到蠟樣芽孢桿菌[7-8]。本文對385份預包裝類食品進行了蠟樣芽孢桿菌的檢測分析，期望為預防食品安全風險隱患，保障人們的飲食安全提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品

共采集8類預包裝食品385份，分別為手抓餅、漢堡餅胚、速凍餡餅、糕點、餅干、速凍餃子、薯類和膨化食品和淀粉及淀粉制品，分別從各縣市超市、零售店、批發市場及農貿市場以及網店購買。

1.2 菌株與試劑

陽性菌株：蠟樣芽孢桿菌（ATCC11778）；陰性菌株：蘇云金芽孢桿菌（ATCC10792）、蕈狀芽孢桿菌（CICC21473）、巨大芽孢桿菌（ATCC14581）、大腸埃希氏菌[CMCC（B）44102]；甘露醇卵黃多粘菌素（MYP）瓊脂（200706）；動力培養基（200528）；硫酸錳營養瓊脂培養基（201204）；胰酪胨大豆羊血（TSSB）瓊脂（200330）；溶菌酶營養肉湯（2090819）；生化鑒定試劑盒（200518）；革蘭氏染色液（陸橋，批號：200831）；BCL鑒定卡（梅里埃）。

1.3 儀器與試劑

BM-20AY落射熒光顯微鏡帶照相系統（上海光學儀器）、濁度儀（法國生物梅里埃公司）、VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統（法國生物梅里埃公司）、BHC-1300Ⅱ生物安全柜（蘇凈集團）、生化培養箱（上海博迅）。

1.4 檢測方法

本試驗根據GB 4789.14-2014標準方法對385份樣品進行蠟樣芽孢桿菌檢驗。對檢出蠟樣芽孢桿菌的樣品取n=5進行檢驗，依次編號為01～05共5組，每組做兩個平行，步驟依次為增菌、分離、鑒定（生化鑒定和全自動生化鑒定儀）、計數。此次檢測前對實驗室的環境、關鍵培養基、菌種進行了驗證，確保實驗準確。

2 結果與分析

2.1 預包裝食品中蠟樣芽孢桿菌檢出情況

通過對385份預包裝食品進行蠟樣芽孢桿菌的檢測，只有速凍餡餅和速凍餃子中檢出蠟樣芽孢桿菌，總檢出率為1.04%，合格率為98.96%。其中，速凍餡餅中蠟樣芽孢桿菌檢出率為5.17%；速凍餃子中蠟樣芽孢桿菌檢出率為1.27%，在幾類食品中速凍餡餅檢出率最高。具體結果見表1。

表1 各類預包裝食品中蠟樣芽孢桿菌檢測結果

2.2 蠟樣芽孢桿菌生化鑒定結果

2.2.1 革蘭氏染色、動力、溶菌酶耐性、溶血、根狀生長和毒素結晶試驗結果

以培養出典型菌落的速凍餡餅樣品為例，進行分析鑒定。挑取粉紅色有沉淀環的可疑菌落（圖1）劃線接種于營養瓊脂平板純培養，進行確證實驗。①革蘭氏染色：單個菌落經革蘭氏染色后，為陽性桿菌，芽孢呈橢圓形，位于菌體中央，多呈短鏈或長鏈狀排列（圖1）。②動力培養：培養基中可疑菌落沿穿刺線呈擴散生長，與蕈狀芽孢桿菌“絨毛狀”生長不同。③溶菌酶試驗：在溶菌酶肉湯（含0.001%溶菌酶）中能生長，溶液渾濁。④溶血試驗：在TSSB瓊脂平板上可疑菌落呈淺灰色，不透明，似白色毛玻璃狀，有溶血環（圖2）。⑤根狀生長試驗：可疑菌落呈粗糙山谷狀生長，蕈狀芽孢桿菌呈根狀生長。⑥蛋白質毒素結晶：可疑菌落與蠟樣芽孢桿菌同樣無蛋白質毒素結晶（圖2）。

圖1 MYP培養基上的菌落和放大1 000X的革蘭陽性桿菌

圖2 溶血試驗、根狀生長試驗、蛋白質毒素結晶試驗

2.2.2 生化鑒定

分別挑取純培養的單個菌落，用生化鑒定試劑盒對可疑菌落進行生化鑒定，符合GB 4789.14—2014中蠟樣芽孢桿菌的生化特征，同時用VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統鑒定可疑菌株與陽性蠟樣芽孢桿菌相似，為97%。

2.2.3 菌落計算

由上述的一系列鏡檢及生化鑒定試驗結果可得知，5份樣品中有1份樣品（編號為03）出現可疑菌落，共挑取6個菌落做生化鑒定，全部鑒定為蠟樣芽孢桿菌。各稀釋度蠟樣芽孢桿菌典型菌落數計數結果如表2所示。編號03組的兩個平行試驗（03-1和03-2）只有10-3稀釋度的各平板菌落數在20～200 CFU，編號03-1的菌落數為（36+40+45）×6/6×103=1.2×105CFU·g-1；03-2的菌落數為（30+39+41）×6/6×103=1.1×105CFU·g-1，03 組 的 平 均 菌 落 數 為1.1×105CFU·g-1。

表2 蠟樣芽孢桿菌在MYP平板上的菌落計數

2.2.4 檢驗結果

根據MYP平板上的蠟樣芽孢桿菌的典型菌落數，報告03菌落數為T=1.1×105CFU·g-1，依據蠟樣芽孢桿菌食物中毒診斷標準及處理原則WS/T 82—1996判定該樣品中蠟樣芽孢桿菌為1.1×105CFU·g-1＞105CFU·g-1，由此可見編號03組速凍餡餅中的蠟樣芽孢桿菌數超過限量，會引起食用者食物中毒。

3 結論與討論

上述檢測結果顯示，385份預包裝食品中速凍餡餅和速凍餃子中檢出蠟樣芽孢桿菌，檢出率分別為5.17%、1.27%。由于餡餅及餃子的基質是面粉、牛肉、豬肉，肉類及米面食品是人體生命活動能量的主要來源，也非常適宜微生物的生長和繁殖，一旦處理不當就極易引起發食物中毒[9]。近些年，由食源性致病菌污染肉類食品和米面制品導致的食物中毒事件屢有發生，李光輝等[10]統計全國食物中毒特征分析，報道由微生物引起的食物中毒占比達38%～63%；江凱等[11]研究發現微生物因素引起的食物中毒占比達58%～72%；李可維等[12]對9 274份肉制品進行食源性致病菌檢測，結果顯示致病菌檢出率最高為調理肉制品（混合類肉制品）。王霄曄等[13]、吳曉旻等[14]分析2018年全國食物中毒事件，由沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌等引起的細菌性食物中毒事件占總數的40%～69%，且多發生在學校、集體食堂和飲食服務單位。

蠟樣芽孢桿菌廣泛存在于自然界中，是一種常見的食源性條件致病菌，易引起嘔吐和腹瀉。本文速凍餡餅樣品中蠟樣芽孢桿菌檢出值為1.1×105CFU·g-1，超過一般安全隱患限值。還有文獻[15]提到食品中蠟樣芽孢桿菌含量在103～105CFU·g-1，食品具有一般安全隱患，即使炒制加熱等仍不能將殺滅該菌。有研究發現[16-18]在由蠟樣芽孢桿菌引發的食物中毒中，部分案例含菌量較少（如＜102CFU·g-1）。因此，低菌量的蠟樣芽孢桿菌污染也存在引發食源性疾病的風險，應引起重視。2018年，宋曉紅等[19]抽檢山西網絡訂餐194份，蠟樣芽孢桿菌檢出率最高，為13.9%，趙薇等[20]調查研究發現百貨商場中蠟樣芽孢桿菌檢出率最高為32.4%，其次是小吃店及飲品店。這些場所所售食品具有快捷方便的特點，部分食品無需復熱和加熱可直接進食。2019年史一等[21]指出山西食源性疾病主要集中在5—10月，食源性疾病發病季節性明顯，該季節濕熱致病菌生長繁殖力強，人們會食用未高溫享調過或加熱不徹底的食品，若存在蠟樣芽孢桿菌污染，大大增加了感染食源性疾病的風險。所以筆者建議居民短時間保存食物最好放置于冰箱中冷藏或冷凍，食用前微波加熱，養成良好的生活習慣。

本文檢測發現冷凍餡餅類食品檢出率較高，主要原因分析如下。①食品原材料存在污染風險。②混合餡料加工過程污染，主要是絞肉、斬拌等加工環節較多，人員、設備、工具和環境衛生不達標，可能造成交叉污染。③運輸過程污染，未保持全程冷鏈。因此，食品企業和監督部門應加大和完善對食品原材料、生產、加工環節、運輸、儲存以及銷售等各個環節的衛生要求，加強對冷凍餡料食品中蠟樣芽孢桿菌的檢測監管，并納入抽檢規劃。提高監測水平，增強消費者食品安全風險防范意識，加強生產加工從業人員的衛生意識培訓，加強衛生監督及執法力度。