紐甜液相色譜檢測方法優化

董立君，賽麗諾，孟千軍，張貴秋，王珊珊，張曉曉

（1.濰坊市產品質量檢驗所，山東濰坊 261000；2.濰坊市檢驗檢測中心，山東濰坊 261000）

紐甜是一種白色結晶粉末狀物質，由美國孟山都公司和法國里昂大學聯合研制，1993年取得化合物專利，2013年9月專利到期，從而在全球得到廣泛應用[1]。紐甜作為一種非營養類增甜劑，甜度為蔗糖的8 000～10 000倍，穩定性較好，在450 ℃高溫焙烤后仍有85%存在[2]。此外，紐甜在血液中存留時間較短，能被人體代謝，同時代謝產物不會在體內積累，是一種相對安全的人工合成甜味劑。

紐甜具有以下特征：①穩定性好，不會對香味、色澤、透明性、黏性等穩定性指標產生影響；②甜味純凈，沒有苦、酸、金屬的異味；③在低濃度0.5 μg·mL-1時，也具有增強改善風味的作用；④無論是在高于或者低于甜度閾值使用，均具有風味休整和增強口味的特征。因為紐甜作為人工合成甜味劑有穩定性好、甜度高、成本低等優點，目前被廣泛應用在食品生產加工中。但由于技術壁壘可能存在一定的安全隱患，添加超量或違法添加等情況不利于人類的健康，對此食品安全國家標準《GB 2760—2014》中對其添加量有詳細規定。

在現行有效的食品安全國家標準GB 5009.247—2016[3]中，流動相采用了離子對試劑緩沖液和梯度洗脫的方式，但在實際工作中發現此方法目標物附近出現干擾峰。為有效解決此問題，特對方法進行優化。

樣品選擇蝦油蘿卜，其成分比較簡單，等度洗脫完全可以較好分離定量紐甜。紐甜在干燥的貯存條件下非常穩定，但制成水溶液后其穩定性會隨著pH和溫度的改變而顯著變化，文獻表明其在pH 3.0～5.5相對穩定[4]，所以選擇1.5 g·L-1磷酸氫二銨溶液（用1 mol·L-1磷酸溶液調pH為3.0～3.5）和乙腈作為流動相（使用時配制）。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

磷酸氫二銨：分析純、上海光復；三乙胺、甲酸：色譜純、科密歐；乙腈：色譜純、美國賽默飛世爾科技公司；紐甜標準品（CAS號：165450-17-9）：北京壇墨、純度99%；固相萃取柱：HLB SPE Cartridge 200 mg/6 mL（60 μm）；Vanquish Core 高效液相色譜儀（配紫外檢測器）：美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件的選擇

色譜柱：納普C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流速：1 mL·min-1；進樣量：10 μL；檢測波長：218 nm；流動相：乙腈∶磷酸氫二銨溶液（0.02 mol·L-1）=30 ∶ 70；洗脫方式：等度。

1.2.2 標準工作液的配制

取1 000 μg·mL-1標準溶液用混合提取液（吸取0.8 mL甲酸和2.5 mL三乙胺，加水定容至1 000 mL，pH約為 4.5）配制成濃度分別為 0.2 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1和 20.0 μg·mL-1標準工作液。

1.2.3 試驗設計

各準確稱取10 g（精確到0.000 1 g）蝦油蘿卜將其勻漿置于3個50 mL具塞離心管中，依次加入100 μg·mL-1標準溶液 20 μL（定量限）、100 μL（5 倍定量限）和 1 000 μg·mL-1標準溶液 100 μL（醬腌菜紐甜限量0.01 g·kg-1），然后各加入30 mL混合提取液，混勻超聲15 min，用混合提取液定容至刻度。分別離心取10 mL上清液，以1 mL·min-1的流速通過HLB固相萃取柱，棄去流出液，用5 mL甲醇以1 mL·min-1的流速洗脫，40 ℃水浴氮吹濃縮，混合提取液定容至2 mL，過濾膜（0.45 μm）上機。同時做空白試驗。

2 結果與分析

2.1 相同濃度不同方法色譜圖對比

將標準溶液上機測試，10 μg·mL-1濃度點優化后的色譜圖相較標準方法明顯沒有干擾峰，更有利于目標物的定性。10 μg·mL-1濃度點優化后的方法和標準方法色譜圖如圖1所示。

圖1 10 μg·mL-1濃度點優化后的方法和標準方法色譜圖（上圖為優化方法，下圖為標準方法）

2.2 定量限的確定

按照國家標準GB 5009.247—2016[3]中的計算公式，當定量限為 0.2 mg·kg-1時，檢測濃度為 0.2 μg·mL-1，信噪比為64.2，大于10符合要求。定量限檢測濃度0.2 μg·mL-1色譜圖如圖 2 所示。

圖2 定量限檢測濃度0.2 μg·mL-1色譜圖

2.3 回收率測定

取蝦油蘿卜按1.2.3試驗過程進行前處理，上機測試空白值為 0 μg·mL-1，同時在定量限、5 倍定量限和醬腌菜紐甜限量值0.01 g·kg-13個點做加標，被測組分含量分別為 0.2 mg·kg-1、1.0 mg·kg-1、10.0 mg·kg-1，回收率分別為88.2%、91.4%、94.1%，分別滿足GB/T 27404—2008[5]中80%～110%、80%～110%、90%～110%的要求。

2.4 校準曲線

上述標準溶液濃度點按照1.2.1的色譜條件上機測試，得出的R2為0.999 9，滿足GB/T 27404—2008[5]中R2不應低于0.99的要求。

2.5 精密度試驗

以實驗室變異系數（Coefficient of Variation，CV）來反應精密度的好壞。CV越小精密度越好，CV越大精密度越差。上述試驗3個加標回收樣品，折回收率實際值分別為 0.176 μg·mL-1、0.914 μg·mL-1、9.410 μg·mL-1，按照1.2.1 的色譜條件各重復進樣7次，結果見表1。

由表1可知，上述試驗設計3個加標回收樣品連進7針實驗室內變異系數（CV）值均小于5%，滿足GB/T 27404——2008要求。

表1 不同濃度精密度實驗結果（單位：μg·mL-1）

3 結論

采取磷酸氫二銨溶液、乙腈作為流動相和等度洗脫方式，目標物的干擾峰消失，解決了實際工作中定性的問題。同時，對優化的方法進行方法確認，試驗結果表明定量限濃度信噪比為64.2，大于10符合要求；被測組分含量分別為 0.2 mg·kg-1、1.0 mg·kg-1、10.0 mg·kg-1回收率分別為88.2%、91.4%、94.1%，均滿足GB/T 27404—2008回收率的要求；R2為0.999 9，滿足GB/T 27404—2008相關系數不應低于0.99的要求；3個加標回收樣品連進7針CV值小于5%，精密度滿足GB/T 27404-2008要求。優化的方法既排除了目標物干擾問題，也因為磷酸氫二銨作為實驗室常用流動相可參與檢測多個物質而有效提高工作效率。