超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞肉中萬古霉素殘留量

裴 娜，陳修紅

（1.國貿食品科學研究院有限公司，北京 102209；2.國家副食品質量檢驗檢測中心，北京 102209）

萬古霉素是由鏈霉菌產生的結構復雜的三環糖肽類抗生素，因具有阻斷細胞壁的合成、改變細胞膜的通透性和阻礙細菌RNA的合成等三重作用機制，對多數革蘭陽性菌具有強大的殺菌作用，可用于治療多數革蘭陽性菌引起的感染[1-3]。萬古霉素能夠減少細菌毒素對動物生長的抑制，經食物鏈進入人體后，會逐漸在體內蓄積而導致各種器官發生病變，如視聽神經受損、肝腎臟發生病變等，因此需要嚴加重視。歐盟在2006年1月，為保障食品安全，全面禁止在飼料中添加任何抗生素；美國從1997年起禁止在畜禽養殖中使用萬古霉素。日本規定牛奶中萬古霉素的限量值為10 μg·kg-1。我國農業部公告第560號規定萬古霉素為禁用獸藥。可靠的殘留檢測方法是進行農產品抽檢和市場監管的基礎和前提，但是目前萬古霉素測定的方法相對較少，標準適用性較窄，且提供的方法實際操作過程相對復雜，穩定性差。基于此，本文擬建立雞肉中萬古霉素的超高效液相色譜三重四極桿串聯質譜（Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測方法，以求更好地為食品安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters Xevo TQ-S超高效液相色譜-串聯質譜儀（美國Waters公司）；Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美國Waters公司）等；Allegra 64R 高速冷凍離心機（美國貝克曼公司）；水浴氮吹儀：NEVAP24型（美國Organomation）；Oasis MCX固相萃取柱（美國waters公司）；電子SSA224-CW天平（感量0.000 1g，美國Sartorius公司）。

鹽酸萬古霉素標準品（CAS號1404-93-9，純度≥96.5%，英國LGC公司）；甲醇、甲酸、乙腈：色譜純（國藥集團化學試劑有限公司）；氨水、鹽酸、正己烷：分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；試驗用水：一級水（美國Mill-pore-Q超純水儀制得）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制

標準儲備溶液：準確稱取鹽酸萬古霉素標準品約10.3 mg（精確至0.1 mg），用少量超純水溶解，并定容至10.0 mL容量瓶中，制得約1 mg·mL-1萬古霉素標準儲備溶液。于-20 ℃條件下保存，有效期3個月。

標準中間液：準確吸取適量上述標準儲備液，用超純水稀釋成濃度為10 μg·mL-1標準中間液，于2～8 ℃條件下保存，有效期1周。

標準系列溶液：取900 μL超純水，加入標準中間液（10 μg·mL-1）100 μL，渦旋混勻，配制出1 μg·mL-1的工作液；再分別吸取1 000 μL、980 μL、960 μL、940 μL、920 μL和900 μL空白基質液，加入1 μg·mL-1的 工 作 液0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL和100 μL，渦旋混勻，得到濃度為0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、40.0 ng·mL-1、60.0 ng·mL-1、80.0 ng·mL-1和100.0 ng·mL-1的基質曲線。

1.2.2 樣品前處理

提取：精密稱取5.0 g（精確到0.001 g）雞肉樣品于具塞離心管中，加入20 mL 0.1%甲酸-乙腈（70∶30，V/V）溶液，加蓋渦旋混勻1 min，超聲提取10 min，于4 ℃、9 500 r·min-1離心5 min，取上清液10 mL，加入10 mL乙腈飽和的正己烷，渦旋混勻，于4 ℃、9 500 r·min-1離心5 min，棄去上層，保留下層清液待凈化。

凈化：取上述下層清液5 mL，上樣前預先用5 mL甲醇、5 mL 0.1 mol·L-1鹽酸活化Oasis MCX固相萃取柱（60 mg/3 mL），取全部待凈化液加入活化后的固相萃取柱，上樣速度為1 mL·min-1，然后用5 mL 甲醇淋洗，淋洗后抽干1 min，用5 mL甲醇-氨水（95∶5，V/V）洗脫，收集全部洗脫液，于40 ℃氮吹至近干，用1.0 mL 0.1%甲酸水溶液復溶，過0.22 μm濾膜，待測。

基質匹配曲線：準確移取萬古霉素標準溶液適量，用空白樣品基質稀釋定容，分別制得不同濃度的基質匹配標準溶液，繪制基質匹配標準曲線（圖1）。

圖1 基質標準曲線

1.2.3 儀器條件

（1）色譜分析條件。Waters Acquity BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：A相為乙腈，B相為含0.1% 甲酸水溶液；流速：0.3 mL·min-1；進樣體積：2 μL；柱溫：30 ℃；梯度洗脫程序：0～0.5 min，5% A；0.5～1.7 min，5%→40% A；1.7～2.5 min，40%→90% A；2.5～3.5 min，90%→5% A；3.5～4.5 min，5% A。

（2）質譜分析條件。離子源：電噴霧電離ESI（+）；源溫度：150 ℃；離子噴霧電壓：3.5 kV；脫溶劑溫度：500 ℃；脫溶劑氣（N2，純度99.999%）；流速：1 000 L·h-1；錐孔氣（N2，純度99.9%）；流速：30 L·h-1；碰撞氣：氬氣，純度99.999%；采用多反應監測模式進行檢測，具體的監測離子與MS參數見表1。

表1 萬古霉素多反應監測離子對及MS參數

2 結果與分析

2.1 前處理方法優化

萬古霉素分子中含有多個羥基，故在水溶液的溶解度很好，微溶于甲醇等有機溶劑[4-6]。本文考察了不同SPE固相萃取柱的回收率和不同溶劑的提取效率。實驗采用5 mL水溶解的50 ng·mL-1萬古霉素標準溶液直接過預活化的固相萃取小柱的方式考察不同萃取柱的回收情況。結果顯示，SCX、MCX、HLB 3種不同SPE小柱對萬古霉素回收率分別為62.30%、80.20%、47.60%，混合陽離子交換MCX小柱回收率最高，如表2所示。進一步考察了3%、5%、8%氨化甲醇對MCX柱的洗脫能力，發現5%氨化甲醇效果最好，回收率達88.28%，具體結果如表3所示。

表2 固相萃取柱回收率

表3 不同濃度洗脫液對MCX柱的回收率

2.2 回收率和精密度

選擇空白雞肉樣品，按本實驗優化的方法進行靈敏度、回收率和精密度的測定，在2.0 μg·kg-1、4.0 μg·kg-1、20.0 μg·kg-13個 濃 度 水 平 加 標，每水平6次平行，計算回收率和相對標準偏差。結果見表4。由此可知，萬古霉素的平均回收率在61.1%～68.3%，精密度RSD在1.77%～3.36%。同時由表5可見在2～100 ng·mL-1目標物線性關系良好，相關系數＞0.999，方法檢出限（S/N=3）為0.43 μg·kg-1，定 量 限（S/N=10）為1.17 μg·kg-1。結果表明，本方法能夠快速、準確、靈敏地測定雞肉中的萬古霉素殘留量。

表4 回收率和精密度

表5 雞肉中萬古霉素的線性范圍、回歸方程、相關系數檢出限和定量限

2.3 實際樣品的測定

為了驗證實驗方法的適用性，選取本地市售20份雞肉樣品，對其中萬古霉素含量進行測定，結果顯示均為陰性，個別樣品結果值0.5～0.9 μg·kg-1，均在定量限以下，可安全食用。

3 結論

本研究建立了雞肉樣品中萬古霉素的超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）檢測方法，通過選擇比較不同陽離子固相萃取柱凈化以及不同濃度的洗脫液等一系列前處理步驟進一步減少了雜質干擾，同時還對比考察了更優的色譜及質譜條件，有效提高了檢測的靈敏度和準確度。方法平均回收率介于61.1%～68.3%，精密度RSD在1.77%～3.36%。該方法前處理簡單、分析時間短、重復性好，能夠快速、準確、靈敏地測定雞肉中的萬古霉素殘留量，滿足日常監測需求。