超高效液相色譜-串聯質譜法快速分析氰霜唑及其代謝物CCIM在水果中的殘留

符靈梅， 王玉健， 徐 莉， 紀少凡

（海口海關技術中心，海南 海口 570311）

氰霜唑（cyazofamid）是2000年由日本石原產業株式會社合成，并與巴斯夫共同開發的咪唑類保護性殺菌劑。氰霜唑對卵菌綱病原菌如疫霉菌、腐霉菌等具有很高的殺菌活性[1-2]。2013年，我國如東眾意化工有限公司成為首家獲得氰霜唑原藥產品登記的企業。目前我國批準登記的作物和防治對象共9種，分別是番茄晚疫病、馬鈴薯晚疫病、荔枝樹霜疫霉病、黃瓜霜霉病、葡萄霜霉病、觀賞菊花霜霉病、薔薇科觀賞花卉霜霉病、西瓜疫病、大白菜根腫病等。氰霜唑使用后會迅速分解，CCIM是氰霜唑在植物體內的主要降解產物，比氰霜唑的毒性高[3]。兩者在農副產品中殘留可能會通過膳食攝入給人們帶來潛在風險。因此，我國的GB 2763—2016《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》標準中規定了氰霜唑及其代謝物在葡萄、荔枝和西瓜的最大殘留限量為1、0.02、0.5 mg/kg；日本對氰霜唑及其代謝物在橙、蘋果、油桃和菠蘿中規定的最大殘留限量為5、1、1、1 mg/kg。

目前，國內外對氰霜唑的殘留分析主要有LCMS/MS法、LC-DAD法和電化學法，這些方法或者只是建立了氰霜唑母體的分析方法，或者樣品前處理煩瑣，有機試劑用量較大。該研究采用超高效液相色譜-串聯質譜技術，并結合QuEChERS樣品前處理方法，建立了同時定性、定量測定水果中氰霜唑及其代謝物CCIM殘留量的分析方法，該方法前處理簡單、能快速定性及定量、準確度高、重現性好，可為開展氰霜唑及其代謝物CCIM在水果中殘留的監管提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氰霜唑（純度98.7%）：Dr.Ehrenstorfer公司產品；CCIM（純度99.9%）：first standard公司產品；乙腈、乙酸、甲酸（均為色譜純）：美國Fisher公司產品；無水硫酸鎂（分析純）：廣州試劑有限公司產品；氯化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司產品；十八烷基硅烷鍵合相（C18）、弗羅里硅土：Agilent公司產品；Milli-Q超純水：法國Millipore公司產品。

超高效液相色譜儀（UPLC）：美國WATERS公司產品；API 4000Q四極桿質譜儀（配有電噴霧離子源）：美國AB公司產品；Harvard II針 泵：美國Varian公司產品；MS3Basic旋渦混勻器：德國IKA公司產品；Centrifuge 5810R離心機：Eppendorf公司產品；G-285電子天平：Mettler公司產品。

1.2 樣品前處理

水果樣品取可食部分切碎、混勻。稱取待測樣品5.000 g于50 mL具塞離心管中，加入20 mL含體積分數1.0%乙酸的乙腈溶液，渦旋振蕩2 min，加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，渦旋混合3 min，以9000 r/min離心5 min，取上清液1.0 mL于玻璃離心管中，分別各加入50 mg C18粉末和弗羅里硅土粉末，渦旋混合30 s，以3000 r/min離心3 min，上清液過0.2 μm有機濾膜，待測。

1.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱為Capcell PAK C18（150 mm×2.0 mm，5 μm）；流動相：A為乙腈，B為體積分數0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫；流量：0.75 mL/min；進樣量：5 μL。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），溫度550℃，電壓5500 V；霧化氣、氣簾氣、輔助氣和碰撞氣均為高純氮氣；正離子多反應監測（MRM）模式。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

根據文獻報道，國內外對氰霜唑和CCIM殘留的分析均采用QuEChERS前處理方法，提取溶劑采用乙腈或含體積分數1.0%乙酸的乙腈，均能得到較好的回收率和精密度。為比較乙腈、含乙酸乙腈的提取效果，采用標準添加法，分別用乙腈、含體積分數1.0%乙酸的乙腈對氰霜唑和CCIM標準物質進行提取（加標量為0.1 μg），計算回收率并采用SPSS（Version 19.0）對數據進行配對樣本T檢驗 （P＜0.05）分析。結果表明，使用乙腈和含體積分數1.0%乙酸的乙腈作為提取溶劑時，氰霜唑回收率的顯著性為0.001（P＜0.05），CCIM回收率的顯著性為0.004（P＜0.05），差異顯著，且使用乙腈作為提取溶劑時，氰霜唑回收率為90.1%～127.0%，RSD為11.67%，CCIM回收率為85.2%～147.0%，RSD為18.98%，超出GB/T 27417—2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》對回收率的要求。使用含體積分數1.0%乙酸的乙腈作為提取溶劑時，氰霜唑回收率為76.4%～105.0%，RSD為7.28%，CCIM回 收 率 為83.8%～108.0%，RSD為7.35%，滿足GB/T 27417—2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》的相應要求。

在pH為4.90～9.56時，酸性越強，氰霜唑在水溶液中就越穩定；隨著OH-離子濃度升高，氰霜唑的磺酸（叔）胺基團越不穩定[4]。為考察乙酸體積分數對氰霜唑、CCIM回收率的影響，采用標準添加法，考察體積分數分別為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%時乙酸乙腈溶液的提取回收率，并采用SPSS（Version 19.0）的Duncan多重比較檢驗法進行顯著性分析（P＜0.05），結果見表1。當提取液乙酸體積分數達到1.0%后，氰霜唑和CCIM的平均回收率無顯著性差異，因此選擇提取液中乙酸體積分數為1.0%。

表1 乙酸體積分數對氰霜唑、CCIM回收率的影響及差異顯著性分析（n=10）Table 1 Influence of acetic acid volume fraction on the recoveries and significance analysis of cyazofamid and CCIM（n=10）

續表1

2.2 提取溶劑體積的選擇

分別使用5、10、15、20、25、30 mL含乙酸體積分數1.0%的乙腈提取1.0 μg氰霜唑和CCIM標準物質，上機進行檢測，以提取液體積為橫坐標，以平均回收率為縱坐標繪圖，結果見圖1。提取液體積為20 mL時，可將1.0 μg氰霜唑和CCIM提取完全，因此選擇提取液體積為20 mL。

圖1 提取液體積與平均回收率關系圖Fig.1 Diagram of extraction volume and average recovery rate

2.3 色譜條件的選擇

根據文獻報道，國內外對氰霜唑和CCIM的殘留分析使用的色譜柱主要有：Phenomenex Kinetex C18柱（100 mm×2.1 mm×2.6 μm）[5]、BEH C18柱（100 mm×2.1 mm×1.7 μm）[6]、Agilent Eclipse XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）[4]、Poroshell 120 EC-C18柱（100 mm×3.0 mm×2.7 μm）[7]、XBridge-C18柱（150 mm×2.1 mm×3.5 μm）[8]、Agilent Eclipse XDB-C18柱（150 mm×2.1 mm×3.5 μm）[9]、Phenomenex Kinetex PFP 100A柱（75 mm×4.6 mm×2.6 μm）[10]、Eclispe plus C18RRHD柱（50 mm×2.1 mm×1.8 μm）[11]、Trace Excel 120ODSA柱（100 mm×4.6 mm×5 μm）[12]。由以上文獻可見，國內外對氰霜唑和CCIM的殘留分析使用的色譜柱主要以C18為填料。作者考察了C18填料、C8填料、苯基柱等3類常見反相柱，包括Capcell PAK C18（2.0 mm×100 mm，5 μm）、Capcell PAK C18（2.0 mm×150 mm，5 μm）、Thermo Accjore C18（3.0 mm×150 mm，2.6 μm）、Phenomenex Kinetex XB-C18（3.0 mm×150 mm，2.6 μm）、BEH C8（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、Eclipse XDB-C8（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Capcell PAK PFP（2.0 mm×150 mm，5 μm）等。結果發現，在表2中洗脫梯度下，Capcell PAK C18（2.0 mm×150 mm，5 μm）分析柱分離效果優于其他反相柱。同時還分別使用甲醇、乙腈作為流動相A，水、體積分數0.1%甲酸水作為流動相B，結果發現，使用乙腈作為流動相A、體積分數0.1%甲酸水作為流動相B時，較之甲醇-水、甲醇-體積分數0.1%甲酸水和乙腈-水流動相，基線平穩，且峰形好。因此選擇Capcell PAK C18柱（2.0 mm×150 mm，5 μm）作為分析柱，乙腈作為流動相A，體積分數0.1%甲酸水作為流動相B，梯度洗脫條件見表2。在上述條件下，0.02 μg/mL氰霜唑及其代謝物CCIM標準溶液的MRM色譜圖見圖2。

表2 流動相梯度洗脫條件Table 2 Mobile phase gradient elution conditions

圖2 氰霜唑及其代謝物CCIM標準溶液的總離子流圖Fig.2 Total ion flow diagram of cyazofamid and CCIM standard solution

2.4 質譜條件的優化及選擇

將氰霜唑和CCIM標準品溶液采用流動注射直接進樣，通過全掃描確定化合物母離子，再對母離子進行二級質譜掃描，得到碎片離子，通過優化條件，得到二級質譜圖。通過MRM選擇相對豐度較高的離子對，確定為定性、定量離子對，并優化去簇電壓、碰撞電壓等參數，綜合考量離子豐度、背景干擾等因素，確定質譜條件見表3，采用電噴霧離子源（ESI），溫度550℃，電壓5500 V，霧化氣、氣簾氣、輔助氣和碰撞氣均為高純氮氣，MRM模式。氰霜唑和CCIM子離子全掃描質譜圖見圖3、圖4。

表3 離子對及相關電壓參數Table 3 Ion pairs and related voltage parameters

圖3 氰霜唑子離子全掃描質譜圖Fig.3 Total scanning of ion mass-spectrogram of cyazofamid

圖4 CCIM子離子全掃描質譜圖Fig.4 Total scanning of ion mass-spectrogram of CCIM

2.5 凈化方法的選擇

由于水果基質復雜，直接提取上機分析會使色素、甾醇和維生素等雜質殘留于分析柱及儀器中，需采用QuEChERS前處理方法進一步凈化[13-14]。分別添加各50 mg的PSA粉末、C18粉末、石墨化炭黑粉末、弗羅里硅土粉末于0.010 mg/kg氰霜唑和CCIM混合標準溶液中，測定其回收率。結果發現PSA粉末、石墨化炭黑粉末對氰霜唑和CCIM有吸附保留，氰霜唑和CCIM的回收率分別為7.9%～29.4%和0～35.8%；使用C18粉末凈化時，氰霜唑和CCIM的回收率分別為83.2%～90.6%和87.9%～93.5%；使用弗羅里硅土粉末凈化時，氰霜唑和CCIM的回收率分別為82.5%～93.2%和89.1%～101.0%；而使用C18粉末和弗羅里硅土粉末作為凈化劑時，氰霜唑和CCIM的回收率分別為88.4%～110.0%、95.2%～108.0%。由此可見，C18粉末和弗羅里硅土粉末混合使用時，凈化效果較佳。因此，選擇C18粉末和弗羅里硅土粉末作為凈化劑。

2.6 基質效應的評價

基質效應（MEs）評價是將在基質匹配校準中獲得的斜率與在標準溶液校準中獲得的斜率進行比較，并計算氰霜唑和CCIM的基質與溶劑的斜率比，使用以下公式計算：MEs（%）=（基質匹配校準中獲得的斜率/標準溶液校準中獲得的斜率-1）×100。通過比較乙腈與不同基質匹配標準溶液的基質效應（質量濃度為0.001～0.040 μg/mL）可得，氰霜唑在葡萄、荔枝、西瓜、蘋果、油桃、橙、菠蘿中的MEs分別為53.85%、32.74%、27.61%、3.70%、4.32%、13.68%、11.84%；CCIM在葡萄、荔枝、西瓜、蘋果、油桃、橙、菠蘿中的MEs分別為33.73%、40.70%、40.58%、7.75%、5.13%、2.73%、7.09%。由此可見，不同樣品基質效應差異顯著，因此選擇基質標準曲線作為定量的校準曲線。

2.7 基質標準曲線的配制

準確吸取一定量的混合標準使用液，用空白基質提取液逐級稀釋成質量濃度為0.001、0.002、0.005、0.010、0.020、0.040 μg/mL的基質混合標準工作溶液，供液相色譜-串聯質譜聯用儀測定，以定量離子峰面積為縱坐標，基質標準溶液質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。線性方程及相關系數見表4。

表4 氰霜唑和CCIM基質標準曲線的線性回歸方程及相關系數Table 4 Linear regression equation and correlation coefficient of matrix standard curves of cyazofamid and CCIM

2.8 方法檢出限和定量限

根據GB/T 27417—2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》，采用空白標準偏差評估法確定方法檢出限和定量限，加入最低可接受質量濃度的樣品作為空白獨立測定10次，得出結果的標準偏差（s），以（空白平均值+4.65s）作為檢出限，以（空白平均值+10s）作為定量限，結果見表5。該方法對葡萄、荔枝、西瓜、蘋果、油桃、橙、菠蘿的定量限滿足國內外對氰霜唑及其代謝物CCIM的限量要求。

表5 不同基質中氰霜唑和CCIM的檢出限和定量限Table 5 LOD and LOQ of cyazofamid and CCIM in different matrices

2.9 方法的精密度、重復性和準確度

在葡萄、荔枝、西瓜、蘋果、油桃、橙、菠蘿陰性樣品中按照表6至表12中的添加水平添加氰霜唑和CCIM標準溶液，每個進行6次平行添加回收實驗，結果表明，在0.004～0.080 mg/kg添加水平內，氰霜唑和CCIM平均回收率分別為80.71%～103.27%和76.62%～100.20%；相對標準偏差分別為4.14%～11.15%和3.24%～11.16%，滿足GB/T 27417—2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》標準規定的要求。

表6 葡萄樣品添加回收率及RSD（n=6）Table 6 Recovery rate and RSD of grape sample（n=6）

表12 菠蘿品添加回收率及RSD（n=6）Table 12 Recovery rate and RSD of pineapple sample（n=6）

表7 荔枝樣品添加回收率及RSD（n=6）Table 7 Recovery rate and RSD of lychee sample（n=6）

表8 西瓜樣品添加回收率及RSD（n=6）Table 8 Recovery rate and RSD of watermelon sample（n=6）

表9 蘋果樣品添加回收率及RSD（n=6）Table 9 Recovery rate and RSD of apple sample（n=6）

表10 油桃樣品添加回收率及RSD（n=6）Table 10 Recovery rate and RSD of nectarine sample（n=6）

表11 橙樣品添加回收率及RSD（n=6）Table 11 Recovery rate and RSD of orange sample（n=6）

3 結語

選用QuEChERS前處理方法，結合超高效液相色譜-串聯質譜技術，建立了同時檢測葡萄、荔枝、西瓜、蘋果、油桃、橙和菠蘿基質樣品中氰霜唑及其代謝物CCIM殘留量的方法。該方法操作簡單、快速、準確、靈敏度高、重現性好，可為農業部門、市場監管部門和第三方檢測機構提供技術參考。