生物法制備煙酸關鍵技術研究

煙酸又稱尼古丁酸、維生素B3、吡啶-3-甲酸，是維持人體生理機能所必需的維生素，在醫藥、化工、食品領域具有廣闊的市場前景。目前煙酸的合成主要為化學合成和生物合成兩種。化學合成法是目前市場上所采用的主要生產手段，但環境污染嚴重、能耗高、產能偏低、產業技術先進性嚴重不足、在國際市場上缺乏競爭力，而且產量無法滿足市場需求。生物催化合成法是近年來快速發展的可替代性顛覆技術，具有環境友好、生產成本低等優勢。

江南大學、浙江工業大學等對生物法制備煙酸關鍵技術進行了深入研究，開展了高產菌株選育、高表達菌株構建及分子改造等工作，實現了高底物濃度生物轉化工藝的構建與放大優化等。如中國專利CN201710580770.1涉及一種腈水解酶組成型表達體系的構建及其在煙酸合成中的應用，所述的腈水解酶組成型表達載體是通過在pET-3b質粒導入惡臭假單胞菌Pseudomonas putida腈水解酶基因編碼序列構建而成，得到重組質粒pET-3b-NIT，轉化至E.coliBL21(DE3)中得到無需進行體外誘導的組成型重組腈水解酶表達菌株，命名為大腸埃希氏菌Escherichia coliNIT-1，現保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No.14254。進一步采用pH-stat補料策略進行精確調控以提升菌體密度和腈水解酶產量，并以大腸埃希氏菌游離細胞為催化劑，以3-氰基吡啶為底物，通過批次投料的方式進行連續轉化生產煙酸。CN201710593822.9公開了一種高產腈水解酶的重組枯草芽孢桿菌及其在煙酸合成中的應用，該方法通過PCR擴增惡臭假單胞菌Pseudomonas putidaCGMCC 3830腈水解酶基因編碼序列并與pMA5質粒相連，構建得到重組質粒pMA5-NIT，轉化至Bacillus subtilisWB600中得到可高效表達腈水解酶的重組菌B.subtilisWB600(pMA5-NIT)，命名為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisNIT-2，現保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.14255。以重組枯草芽孢桿菌游離細胞為催化劑，可將3-氰基吡啶完全轉化生成煙酸。CN201710666240.9提供一種含腈水解酶的惡臭假單胞菌Pseudomonas putida突變體mut-D3的細胞復合固定化方法及其在煙酸制備中的應用。該發明具體是將海藻酸鈉溶液與PVA(聚乙烯醇)按照一定比例混合，作為固定材料，再與制備好的菌懸液混合，滴入預冷的固化液中進行固定。獲得的固定化細胞對高濃度底物耐受性大大增強，可應用于煙酸的高效轉化合成，相比于游離細胞煙酸產量提高約2倍。CN201310570085.2涉及一種將產腈水解酶的赤霉菌CA3-1（Gibberella intermedia，CGMCC No.4903）用聚乙烯醇-殼聚糖、海藻酸鈉-明膠復合材料固定化并分別用戊二醛和京尼平進行交聯處理后用于制備煙酸的方法。研究發現，用京尼平交聯處理的殼聚糖-聚乙烯醇固定化細胞保留活力和重復利用性比戊二醛交聯處理的固定化細胞要好，并且比海藻酸鈉-明膠復合材料活力高?？梢灾貜屠枚啻?，有較高的底物耐受性，能提高單位菌體的生產能力。CN201210386670.2公開了一種再育鐮刀菌（Fusarium proliferatum）ZJB-09150及在生物合成煙酸中的應用，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC No.M2011472，保藏日期2011年12月15日。所述合成煙酸的方法為：以再育鐮刀菌ZJB-09150發酵培養獲得的含酶濕菌體為催化劑，以3-氰基吡啶為底物，于pH 7.0～10.0的緩沖溶液中構成轉化反應體系，在35～55℃條件下進行轉化反應，反應完全后，轉化反應液即為含煙酸的混合液，混合液分離純化獲得所述煙酸。商玉婷等采用氨基化核殼結構磁性Fe3O4納米粒子對重組腈水解酶進行固定化并對制備條件進行優化。并通過考察磁性固定化細胞的溫度穩定性、底物耐受性和初始底物濃度對轉化效率的影響，確定磁性固定化細胞轉化3-氰基吡啶為煙酸的工藝條件,以進一步增強重組腈水解酶的煙酸生產能力。李禾研究了敏捷嗜酸菌來源腈水解酶的分子改造及在煙酸生產中的應用，從敏捷嗜酸菌Acidovorax facilis72W中克隆腈水解酶編碼基因，實現了其在大腸桿菌中的高效異源表達，并對腈水解酶NitA的酶學性質與生物催化性質進行表征。進一步針對腈水解酶NitA催化活性低、熱穩定性差等問題，通過定點突變與隨機突變等手段篩選到酶活力提高與穩定性增強的突變體NitA-C2和H135A。

隨著我國經濟的發展和人民生活水平的提高，我國對煙酸及其衍生物的需求將迅速增加。研究人員應大力開發和研制新的煙酸及其衍生物的合成路線，尋求生產工藝簡單、環境友好、綠色化學的發展方向，合成更高效的醫藥、食品添加劑等方面的精細化工產品。