基于氣相離子遷移譜技術的不同產地烏龍茶揮發性物質分析

甘 爽， 陳志丹， 商 虎，3， 林 琳，3， 孫威江*，3

（1．福建農林大學 園藝學院，福建 福州 350002；2．福建農林大學 安溪茶學院，福建 泉州 362400；3．福建省茶產業工程技術研究中心，福建 福州 350002）

烏龍茶是我國六大茶類之一，屬半發酵茶，是我國的特色茶之一，因其特有的花香及醇厚鮮爽等風味品質而馳名中外。烏龍茶起源于我國福建，主產于我國的福建、廣東和臺灣地區，由于產地、茶樹品種和氣候條件等因素的不同，形成了各產地烏龍茶風格特異的風味特征[1]?，F階段，茶葉感官審評是評價茶葉品質最普遍、最直觀的方式[2]，是依靠人的感官對茶葉品質的綜合判定，而茶葉香氣占茶葉品質感官評分的30%[3]，由此可見，茶葉香氣是茶葉感官品質評價的一個重要指標[4]，而揮發性化合物不僅是茶葉香氣的重要組分，也是影響茶葉感官品質的重要因素。傳統的香氣評分方式，很大程度上依賴于專業評茶師的個人喜好和自身經驗，且容易受環境、情緒等諸多因素的影響，審評結果較為主觀，很難被廣大消費者所接受。而茶葉揮發性物質相關的理化指標檢測，一般采用常規的物理化學分析法和儀器分析法[5-9]，雖然這些方法較為客觀，但步驟復雜、耗時長，無法對茶葉的揮發性化合物指標進行快速檢測，因此迫切需要尋找一種客觀且快速、無損的技術對茶葉揮發性物質進行分析。

離子遷移譜（ion mobility spectrometry，IMS）是基于氣相中不同的氣相離子在電場中遷移速度的差異來對化合物進行定性分析的一項技術，是一種快捷的檢測分析手段[10]，與傳統GC-MS分析方法相比，GC-IMS技術不需要對樣品進行前處理，具有檢測限低、簡單易用、耗時短、成本低等特點，離子遷移譜已經得到廣泛應用，如油類的真假鑒別[11-13]、咖啡豆鑒別及儲藏時間鑒定[14]、食品風味分析[15-23]。林若川等通過GC-IMS技術對云霧茶、翠尖茶和龍井茶進行產地判別，但該技術在我國廣東、福建、臺灣地區所產烏龍茶香氣區分方面的研究尚未見報道[24]。因此，采用GC-IMS技術對我國廣東、閩南地區、閩北地區、臺灣地區不同產地烏龍茶中的揮發性物質進行快速檢測，并通過PCA、PLS-DA法對烏龍茶產地進行區分，為烏龍茶揮發性物質的快速檢測提供新的解決方式。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烏龍茶選自國際標準烏龍茶工作組（ISO/TC34/SC8/WG7）采集的烏龍茶樣品，均為2018年的春茶。如表1所示，選取我國最具代表性的4個產地（分別為廣東、閩南地區、閩北地區、臺灣地區）的烏龍茶樣品，其中廣東烏龍茶8個、閩南地區7個、閩北地區8個、臺灣地區6個，共對29個烏龍茶樣品進行揮發性物質分析。

表1 我國不同產地烏龍茶樣品信息Table 1 Information of oolong tea samples from different origins in China

Flavour Spec?風味分析儀：濟南海能儀器股份有限公司產品；FW高速粉碎機：上海鼎廣機械設備有限公司產品；FA1004電子天平：德國Sartorius公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 審評方法由3名具備5年以上專業描述性審評經驗的專家，4名具備3年以上審評經驗的高級評茶員，合計7名審評人員，按照GB/T 23776—2018進行感官審評，并對香氣進行評分。

1.2.2 香氣檢測方法被分析的茶葉樣品于室溫下密封儲存，檢測前將茶樣用高速粉碎機磨碎并過80目篩，置于-20℃保存。檢測前用電子天平將每個樣品稱取0.2000 g，分別置于20 mL頂空進樣瓶中并密封，樣品瓶按順序排列待檢，每個樣品重復3次。設置好儀器參數后，儀器按程序自動工作，分析前10 min儀器將樣品瓶移至孵化區加熱并振蕩，進樣針抽取500 μL頂空瓶內的氣體，注入色譜柱進行分析。

色譜柱：FS-SE-54-CB-1；漂移氣：高純氮氣，純度≥99.999%；漂移氣流量：150 mL/min；色譜柱溫度：60℃；進樣口溫度：80℃；IMS探測器溫度：45℃；漂移管溫度：40℃；頂空進樣針溫度：90℃；進樣量：500 μL；孵化轉速：500 r/min；頂空孵化溫度：70℃；孵化時間：10 min；分析時間：30 min；高純氮氣（純度≥99.999%）清洗頂空針時間：5 min；載氣流量程序：起始流量2 mL/min，保持2 min后10 min內線性增加至10 mL/min，保持10 min后30 min內線性增加至130 mL/min。

1.3 數據處理

利用儀器自帶的Laboratory Analytical Viewer分析軟件中的兩款插件（Reporter插件、Gallery Plot插件）以及GC×IMS Library Search對樣品進行定性、定量分析。采用Excel對數據進行統計。采用SIMCA 14.1進行PCA、PLS-DA分析。使用Python進行LDA分析。

2 結果與分析

2.1 不同產地烏龍茶揮發性化合物氣相離子遷移譜圖分析

IMS譜圖中的每個特征峰代表一種揮發性有機成分，不同揮發性物質在相應位置有對應的信號峰，我國不同產地的烏龍茶揮發性物質的出峰位置、數量大致相同，但各自含量有所差異。根據差譜原則，選擇揮發性成分較少的臺灣地區烏龍茶樣品作為參照進行差譜分析，結果見圖1。4個產地烏龍茶樣品的譜圖中，同一組分含量相同的部分顏色抵消為白色，紅色則表示該揮發性物質的含量比參比樣品高，藍色則表示該揮發性物質的含量比參比樣品低。在臺灣地區烏龍茶的樣品中，紅框部分揮發性物質明顯低于其他3個產地烏龍茶，說明各揮發性物質的含量受產地影響。

圖1 不同產地烏龍茶樣品的GC-IMS差異圖譜Fig.1 GC-IMS differential atlas of oolong tea samples from different origins

2.2 不同產地烏龍茶揮發性化合物定性分析

從GC-IMS Library Search中利用離子遷移時間以及保留指數對揮發性化合物進行了定性，這些物質保留時間相近，但遷移時間有所不同。樣品的揮發性化合物定性分析結果見圖2。

圖2 烏龍茶中揮發性化合物信號峰位置點Fig.2 Signal peaks of volatile compounds in oolong tea

表2中列出了檢測樣品中所有已鑒定的物質，檢出的43種物質可歸為9類，包含1種酚類、1種碳氫化合物、2種雜氧化合物、2種吡咯類、2種酯類、5種酸類、6種酮類、11種醇類和13種醛類。

表2 不同產地烏龍茶中揮發性物質的定性Table 2 Volatile compounds identified by GC-IMS of oolong tea from different origins

續表2

2.3 不同產地烏龍茶揮發性成分的指紋圖譜分析

使用Gallery Plot插件生成不同產地烏龍茶的指紋圖譜（見圖3），橫軸方向為標記的特征離子峰，從左往右依次排列，其中每一行代表一個揮發性化合物，每一列表示不同樣品之間同一種揮發性化合物的對比。特征離子峰顏色的深淺程度代表揮發性化合物含量的高低，顏色越亮，含量越高，反之，則越低。根據圖譜能對不同烏龍茶之間揮發性化合物差異進行直觀比較。如圖3所示，我國不同產地烏龍茶樣品差異顯著，如廣東烏龍茶中2-乙基吡嗪、檸檬烯、2，6-二甲基吡嗪含量較高；閩南地區烏龍茶中苯甲醛、辛醛、庚醛、己醛、正丁酸、反-2-庚烯醛、3-辛酮含量較高；閩北地區烏龍茶中對乙基苯酚、癸醛、2-庚酮、反-2，4-庚二烯醛、γ-丁內酯、5-甲基糠醛、反-2-辛烯醛、苯乙醇、2-甲基丁醇、甲基苯甲醇、順-3-壬烯醇含量較高；臺灣地區烏龍茶中2-庚酮、糠醛、γ-丁內酯、2-乙?；秽?、戊醇、乙酸、正己醛、2-己酮、戊醛、丙酸含量較高。

圖3 我國烏龍茶中揮發性化合物的指紋圖譜Fig.3 Fingerprints of volatile compounds in oolong tea in China

2.4 不同產地烏龍茶揮發性成分的主成分分析

不同揮發性物質的特征峰對應不同的響應強度，這些特征峰強度能反映茶葉樣品之間的差異。根據指紋圖譜，可直接觀察特征峰的顏色亮度對不同產地烏龍茶進行區分，但為了避免直接觀察過于主觀，利用Laboratory Analytical Viewer分析軟件中的插件讀取各個揮發性化合物的峰值強度，將所得數據進行量化，進行PCA分析，從而對不同烏龍茶樣品進行產地區分，結果見圖4。其中PC1的貢獻率為54.2%，PC2的貢獻率為19.4%，累計貢獻率為73.6%。4個產地的烏龍茶樣品基本能夠區分開，說明該技術能有效區分不同產地的烏龍茶。同時，因為不同產地間烏龍茶制作工藝的相似性，使得組別間有較為接近的部分，這一點在圖4也有體現；此外，組內的樣品，雖屬同一個產地，但由于品種差異等因素，使得其自身品質也有所差異，致使數據點也相對離散。

圖4 烏龍茶樣品GC-IMS特征變量的主成分分析Fig.4 PCA of GC-IMS characteristic variables of oolong tea samples

表3 我國不同產地烏龍茶的特征揮發性物質Table 3 Characteristic volatile matter of oolong tea from different producing areas in China

2.5 不同產地烏龍茶揮發性成分的偏最小二乘法判別分析

PLS-DA是一種聚類分析方法，通過擴大組間差異、減少組內差異，可以彌補PCA的缺點。其中PC1的貢獻率為54.2%，PC2的貢獻率為19.3%，累計貢獻率為73.5%。圖5（a）證明該研究能將不同地區烏龍茶樣品很好地區分開，圖5（b）說明該模型沒有出現過擬合現象，穩定性較好，具有較好的預測能力。

因子載荷圖反映了每個變量對得分圖的貢獻，圖5（c）中每個點代表一種揮發性化合物，可通過它們與原點之間的距離來評估這些物質對產地判別的貢獻度。變量投影重要性（variable important for the projection，VIP）是通過PLS-DA載荷圖判別所得，通過VIP＞1共篩選出16種標志揮發性化合物，見圖5（d）。篩選出的標志揮發性化合物在圖5（c）中以紅色標注，這16種揮發性化合物分別是：反-2，4-庚二烯醛（8）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（18）、糠醛（6）、丙醇（64）、反-2-己烯-1-醇（17）、2-甲基丙酸（13）、戊醇（23）、丙醇（63）、2-庚酮（3）、2-乙?；秽?5）、γ-丁內酯（10）、正己醛（40）、5-甲基糠醛（20）、丙酸（53）、苯甲醛（22）、氧化芳樟醇（56），這些物質對4個產地烏龍茶的區分有突出貢獻。

圖5 烏龍茶樣品GC-IMS特征變量的PLS-DA分析Fig.5 PLS-DA analysis of GC-IMS characteristic variables of oolong tea samples

2.6 不同產地烏龍茶揮發性成分的線性判別分析

LDA是對費舍爾的線性鑒別方法的歸納，這種方法使用統計學、模式識別和機器學習方法，試圖找到事件特征的一個線性組合，以能夠特征化或區分它們[10]。采用LDA算法進一步研究烏龍茶產地識別的可能性，以我國4個不同產地的29個烏龍茶樣本建立對應的產地判別模型。分別選取不同產地烏龍茶樣品數量的75%樣品作為訓練集，剩余25%樣品量作為預測集，統計結果見表4，判別結果見圖6，準確率均為100%，表明該模型穩健、可靠。由此可知，采用LDA算法可以較好地用于對烏龍茶產地的判別。

圖6 我國不同產地烏龍茶樣品的LDA判別結果Fig.6 LDA discrimination of oolong tea samples from different areas in China

表4 LDA模型鑒別我國烏龍茶產地的統計結果Table 4 Statistical results of Chinese oolong tea identified by LDA model

3 結語

采用GC-IMS技術分析我國不同產地烏龍茶揮發性化合物的差異，對29個來自不同產地的烏龍茶樣品進行揮發性物質檢測，鑒定出43種揮發性物質，可分為9類，包含1種酚類、1種碳氫化合物、2種雜氧化合物、2種吡咯類、2種酯類、5種酸類、6種酮類、11種醇類和13種醛類。

由IMS圖譜可知，我國不同產地烏龍茶的揮發性物質差異主要體現在含量上。由前人研究可知，輕火烘焙的烏龍茶一般帶有清香或淡花香；中火烘焙則帶有花香或花果香；足火烘焙后的烏龍茶具有明顯果香或果糖香；而高火烘焙則具有明顯焦糖香或火功香[25]。實驗選擇的閩南地區烏龍茶以清香為主，焙火程度最輕，其次是廣東烏龍茶、臺灣地區烏龍茶，焙火溫度最高的則是閩北地區烏龍茶，產生這些香氣特征主要是由焙火溫度引起的，因此造成了4個產地烏龍茶風格各異的香氣特征。這與該研究中檢測到的呈香揮發性物質特征規律大體是一致的。檢測到呈柑橘香的檸檬烯在廣東烏龍茶中含量較高，與前人研究一致[26]。閩南地區烏龍茶是4個產地里焙火溫度最低的，具有青草香特征的庚醛、己醛、3-辛酮含量明顯高于其他產地的烏龍茶；臺灣地區烏龍茶中具有果香氣特征的2-己酮、丙酸、γ-丁內酯、正己醛等含量較為突出。周雪芳研究表明，武夷巖茶隨著焙火溫度增加，茶葉中具有焙烤香的揮發性化合物增加[27]，如閩北地區烏龍茶具有烘烤香呈香特性的反-2，4-庚二烯醛、對乙基苯酚、5-甲基糠醛的信號峰較強也驗證了這一點。

根據特征峰的峰值強度數據結合PCA、PLSDA、LDA多元統計分析方法，不同產地烏龍茶能根據其揮發性化合物的含量進行區分，說明該技術對區分產地有效，即檢出的各個物質及其含量能有效代表烏龍茶產地信息，驗證了檢測結果的準確性和有效性。因此，GC-IMS技術能有效且快捷地運用于不同產地烏龍茶的區分。GC-IMS技術用于茶葉方面的研究較少，由于茶葉揮發性物質的數據庫尚未完善，使得鑒別出的揮發性物質不及GC-MS的多。查詢到的43種物質僅是烏龍茶揮發性物質的一部分，雖不能概括烏龍茶的整個揮發性物質體系，但根據判別結果可知，具有代表性，且與GC-MS相比，該技術不用對樣品進行前處理，檢測方法較簡單，表明GC-IMS技術在烏龍茶產地區分上仍有其特有的優勢。