羊肉凍融過程中蛋白質(zhì)變性的DSC熱學(xué)分析

肖 宇， 古明輝， 張昊陽(yáng)， 劉永峰

（陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062）

冷凍肉在現(xiàn)代肉及肉制品加工工業(yè)中占據(jù)重要地位。隨著我國(guó)近幾年羊肉產(chǎn)值穩(wěn)步增長(zhǎng)，羊肉市場(chǎng)需求量較大，為保證肉品質(zhì)，大部分的羊肉都是以冷凍的方式在市場(chǎng)流通[1-2]。雖然肉的凍藏能抑制絕大部分微生物的增殖、降低生物酶活性、延長(zhǎng)貯藏期、保障肉品質(zhì)，以推進(jìn)全球肉類商業(yè)化的進(jìn)程，但在羊肉凍結(jié)過程中，冰晶體積增大時(shí)破壞細(xì)胞膜，引起解凍后汁液流失，蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分及眾多風(fēng)味物質(zhì)損失，導(dǎo)致肉及肉制品的品質(zhì)降低[3-4]。更值得關(guān)注的是，由于羊肉在流通過程冷鏈不健全，凍藏運(yùn)輸、包裝、零售前的修整及消費(fèi)者購(gòu)買后再次冷藏都會(huì)使羊肉有意或無意被多次凍融，特別在偏遠(yuǎn)地區(qū)冷凍肉的儲(chǔ)運(yùn)期間，凍融現(xiàn)象更嚴(yán)重[5]。此外，羊肉在凍融過程中，蛋白質(zhì)發(fā)生冷變性，主要有兩種類型：一是蛋白質(zhì)的聚集，凍結(jié)過程中冰晶的形成使水分子從親水基團(tuán)上脫離，這些游離的功能基團(tuán)相互作用，使蛋白質(zhì)分子聚集；二是蛋白質(zhì)多肽鏈的展開，高度水化的蛋白質(zhì)具有較高的焓值，凍結(jié)過程中冰晶形成促使多肽鏈水化程度降低，導(dǎo)致焓值降低[6]。并且，隨著凍融循環(huán)次數(shù)增加，蛋白質(zhì)冷變性作用隨之加劇，降低肉品質(zhì)[6-7]。因此，檢測(cè)凍融過程中蛋白變性情況對(duì)評(píng)價(jià)肉品質(zhì)具有重要意義。

差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）法可用于表征食品物料的熱性能和熱反應(yīng)，利用其檢測(cè)得到的熱轉(zhuǎn)變溫度和熱轉(zhuǎn)變對(duì)應(yīng)的焓變，能對(duì)食品物料中的水分和蛋白質(zhì)活性狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估[8]。陳清敏探究了牛肉反復(fù)凍融后DSC曲線的變化，發(fā)現(xiàn)肌球蛋白變性程度隨著凍融次數(shù)增加而增加[9]；臺(tái)瑞瑞對(duì)比了黑鱸在緩凍和速凍后DSC曲線的變化，發(fā)現(xiàn)速凍對(duì)蛋白質(zhì)變性影響比緩凍小[10]；何向麗利用DSC法研究了不同解凍方法對(duì)豬里脊的影響，發(fā)現(xiàn)空氣解凍對(duì)蛋白質(zhì)變性的影響較小[11]。這些研究利用冰箱或冷庫(kù)對(duì)肉樣進(jìn)行冷凍，凍融處理后制樣，再利用DSC法對(duì)肉樣中蛋白質(zhì)變性情況進(jìn)行分析，能夠反映真實(shí)凍融過程肉中蛋白質(zhì)的冷變性情況，但由于DSC儀器處理量小和單個(gè)樣品測(cè)樣時(shí)間長(zhǎng)等特性，使得制樣到測(cè)樣之間的時(shí)長(zhǎng)難以控制，這期間肉質(zhì)可能發(fā)生變化，使結(jié)果不能準(zhǔn)確地反映凍融后蛋白質(zhì)變性情況。

綜上，對(duì)冷凍后的肉樣切片，利用DSC液氮冷凍系統(tǒng)對(duì)測(cè)定樣品進(jìn)行凍融處理，探索凍融過程中不同最低凍融溫度、不同凍融次數(shù)下的羊肉DSC熱焓曲線變化，并考慮制樣到測(cè)樣之間時(shí)長(zhǎng)、樣品質(zhì)量給DSC熱焓曲線帶來的影響，以期為DSC法應(yīng)用于肉類研究提供更加充分的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肉：采樣自新疆華凌畜牧屠宰基地，選取健康成年新疆山羊，宰后取其左右兩側(cè)背最長(zhǎng)肌，于4℃環(huán)境中成熟24 h后置于干冰中，運(yùn)輸回陜西實(shí)驗(yàn)室，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱貯藏，待用。

1.2 儀器與設(shè)備

DSC Q1000型差示掃描量熱儀：美國(guó)TA公司產(chǎn)品；超低溫冷凍儲(chǔ)存箱：中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備從-80℃冰箱中取出羊肉樣品，沿肌纖維方向隨機(jī)切成10～30 mg厚度均勻的薄片，記錄樣品質(zhì)量；進(jìn)行DSC測(cè)定，并記錄樣品從切片到進(jìn)行DSC測(cè)定之間的時(shí)長(zhǎng)。

1.3.2 DSC測(cè)定程序參照何向麗的程序進(jìn)行測(cè)定[11]，略有修改。以空盤作對(duì)照（未放置樣品），將樣品分為未凍融（not freeze-thaw，NFT）組、-20℃凍融1次（-20℃freeze-thaw once，TFT1）組、-20℃凍融2次（-20℃freeze-thaw twice，TFT2）組、-80℃凍融1次（-80℃freeze-thaw once，EFT1）組，每組樣品至少重復(fù)測(cè)定3次，此外，-20℃凍融表示最低凍融循環(huán)溫度為-20℃，-80℃凍融表示最低凍融循環(huán)溫度為-80℃；由于運(yùn)輸條件限制，樣品在DSC測(cè)定之前已經(jīng)過1次最低凍融溫度為-80℃的凍融過程，即文中凍融次數(shù)均是DSC儀器凍融次數(shù)。具體方案如下：

1）NFT組 肉樣在25℃平衡5 min，然后以5℃/min升溫到150℃。

2）TFT1組 肉樣在25℃平衡5 min，之后以1℃/min降溫到-20℃，然后以1℃/min升溫到25℃，平衡5 min，再以5℃/min升溫到150℃。

3）TFT2組 肉樣在25℃平衡5 min，之后以1℃/min降溫到-20℃，然后以1℃/min升溫到25℃，再以1℃/min降溫到-20℃，以1℃/min升溫到25℃，平衡5 min，然后以5℃/min升溫到150℃。

4）EFT1組 肉樣在25℃平衡5 min，之后以1℃/min降溫到-80℃。然后以1℃/min升溫到25℃，平衡5 min，再以5℃/min升溫到150℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用TA Universal Analysis軟件對(duì)升溫曲線熱相圖進(jìn)行分析，得到起始溫度（Ton，℃）、峰值溫度（Tp，℃）和熱吸收峰焓值（ΔH，J/g）。采用Excel 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。通過Origin 2018軟件進(jìn)行雙標(biāo)圖的相似性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍融次數(shù)對(duì)DSC曲線的影響

對(duì)樣品進(jìn)行最低凍融溫度-20℃的2次凍融處理，25～150℃部分升溫曲線如圖1所示。3種凍融次數(shù)樣品的升溫曲線都在80℃和100℃左右出峰，此外，NFT組和TFT1組在60℃左右出峰，NFT組在85℃左右出峰。按照曲線出峰的溫度順序，4個(gè)熱轉(zhuǎn)變峰分別命名為峰1、峰2、峰3和峰4，其中峰1代表肌球蛋白引起的熱流變化[12]，峰2代表肌動(dòng)蛋白引起的熱流變化[13]，峰3可能代表肌聯(lián)蛋白引起的熱流變化[14]，峰4代表水分迅速蒸騰引起的熱流變化。這些熱轉(zhuǎn)變峰對(duì)應(yīng)的熱焓值，峰4最大，峰2次之，峰1最小。表1具體列舉了最低凍融溫度為-20℃的3種處理的4個(gè)峰的Ton、Tp和ΔH。

圖1 最低溫度-20℃凍融升溫曲線熱相圖Fig.1 Thermal phase diagram of freezing-thawing heating curve with the minimum temperature of-20℃

表1 最低溫度-20℃凍融升溫曲線熱相圖熱力學(xué)指標(biāo)Table 1 Thermodynamic indexes of thermal phase diagram of freezing-thawing heating curve with the minimum temperature of-20℃

結(jié)合圖1和表1可知，樣品在凍融處理后出峰位置發(fā)生了偏移。3種處理中TFT2組沒有峰1，TFT1組和TFT2組沒有峰3。TFT1組的峰2較NFT組稍微向低溫偏移，其Ton2和Tp2在3種凍融處理下最低；TFT2組的峰2較NFT組向高溫偏移，其Ton2和Tp2在3種凍融處理下最高。3種凍融處理組的ΔH2隨凍融次數(shù)增加而依次降低，TFT1組的ΔH2比NFT組降低了47.0%（P＜0.05），TFT2組的ΔH2比NFT組降低了68.8%（P＜0.05）。與3個(gè)處理組的峰2變化規(guī)律相似，NFT組的Ton4和Tp4在3種凍融處理下居中；TFT1組的Ton4在3種凍融處理中最低；TFT2組的Ton4和Tp4在3種凍融處理中最高。NFT組和TFT1組的ΔH4相差不大，TFT2組ΔH4相對(duì)較小。

峰起始溫度Ton和峰值溫度Tp反映了羊肉中活性蛋白質(zhì)對(duì)加熱的敏感性，Ton和Tp越大，說明該成分熱穩(wěn)定性越強(qiáng)。熱焓值ΔH的大小反映了蛋白質(zhì)的變性程度，對(duì)于同一物質(zhì)的不同處理，ΔH越大，說明在升溫到變性溫度之前，蛋白質(zhì)的變性程度越小。一方面，兩個(gè)凍融處理組的ΔH2隨著凍融次數(shù)的增加顯著下降，且Ton2和Tp2與未凍融組相比發(fā)生偏移，說明凍融過程不僅會(huì)使肌動(dòng)蛋白發(fā)生變性，還會(huì)影響肌動(dòng)蛋白的穩(wěn)定性。另一方面，隨著凍融次數(shù)增加，TFT2組峰1消失，TFT1組和TFT2組峰3消失，說明凍融次數(shù)增加導(dǎo)致肌球蛋白和肌聯(lián)蛋白變性程度加劇。肉中的部分水分在凍融和升溫的過程中散失，當(dāng)溫度達(dá)到100℃左右時(shí)，非游離水迅速轉(zhuǎn)化為自由水并在達(dá)到沸點(diǎn)后迅速蒸騰，導(dǎo)致峰4出現(xiàn)[15]。TFT1組的ΔH4比NFT組升高了1.3%（P＞0.05），說明進(jìn)行最低凍融溫度-20℃凍融1次對(duì)樣品水分的影響較小；TFT2組的ΔH4比NFT組降低了11.9%（P＜0.05），說明進(jìn)行最低凍融溫度-20℃凍融2次對(duì)水分有明顯影響。另外，所有處理組在98℃左右出現(xiàn)一個(gè)小峰，這可能是由于溫度達(dá)到DNA變性溫度，DNA發(fā)生解旋導(dǎo)致[16]。綜上可知，在最低溫度為-20℃的凍融處理下，凍融次數(shù)對(duì)羊肉的DSC升溫曲線具有明顯影響。

2.2 凍融溫度對(duì)DSC曲線的影響

對(duì)樣品進(jìn)行了未凍融（NFT）、-20℃凍融1次（TFT1）、-80℃凍融1次（EFT1）處理，25～150℃部分升溫曲線如圖2所示。相較于NFT組和TFT1組，EFT1組峰1和峰2變小，峰4變大，表2具體列舉了最低凍融溫度為-20℃和-80℃的4個(gè)峰的Ton、Tp和ΔH。3種凍融處理組的ΔH1和ΔH2隨最低凍融溫度下降而依次降低，TFT1組和EFT1組的ΔH1比NFT組分別降低了57.0%（P＜0.05）和89.6%（P＜0.05）；TFT1組和EFT1組的ΔH2比NFT組分別降低了47.0%（P＜0.05）和59.6%（P＜0.05）。這表明更低的凍融溫度對(duì)蛋白質(zhì)變性的影響更大，且肌球蛋白比肌動(dòng)蛋白更容易受到凍融的影響。TFT1組的ΔH4比NFT組升高了1.3%（P＞0.05），EFT1組的ΔH4比NFT組增大了15.6%（P＜0.05），表明更低的凍融溫度降低了羊肉凍融過程中水分的散失。

表2 不同最低凍融溫度下DSC熱力學(xué)指標(biāo)Table 2 DSC thermodynamic indexes of freezing-thawing heating curve with different minimum temperatures

圖2 不同最低凍融溫度升溫曲線熱相圖Fig.2 Thermal phase diagram of freezing-thawing heating curve with different minimum temperatures

2.3 DSC曲線指標(biāo)主成分分析

由于DSC程序運(yùn)行較為耗時(shí)，單次只能測(cè)試1個(gè)樣品，從制樣到測(cè)樣之間存在不同的時(shí)長(zhǎng)，使同一樣品不同測(cè)定之間的DSC曲線出現(xiàn)小部分差異。考慮到這種不確定因素，統(tǒng)計(jì)了24次最低凍融溫度為-20℃的DSC曲線70～110℃的部分結(jié)果，其中包括了NFT、TFT1以及TFT2，結(jié)果見圖3。

以凍融次數(shù)對(duì)24次測(cè)定進(jìn)行分組，按照制樣到測(cè)樣間時(shí)長(zhǎng)的增大順序進(jìn)行組內(nèi)排序，由于部分測(cè)定組的DSC曲線沒有出現(xiàn)峰1，為保證結(jié)果的可信度，圖3沒有將ΔH1納入考量。在圖3中，PC1和PC2解釋了數(shù)據(jù)中64.7%的可變性。圖中線段之間的夾角表示各指標(biāo)相互之間的影響，線段之間的夾角小于90°表明正相關(guān)，兩線段之間夾角越小，正相關(guān)性越強(qiáng)。從圖中可知，制樣到測(cè)樣之間時(shí)長(zhǎng)和ΔH2呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)，說明時(shí)長(zhǎng)增加會(huì)加劇肌動(dòng)蛋白變性。雙標(biāo)圖中兩點(diǎn)距離表示樣本差異大小，兩點(diǎn)距離近，說明相似性較好，兩點(diǎn)距離遠(yuǎn)則表明相似性較差。根據(jù)圖3可知，NFT的點(diǎn)與TFT2的點(diǎn)相距較遠(yuǎn)，TFT1的點(diǎn)則分布在兩者之間，說明凍融次數(shù)增加，肉的蛋白質(zhì)變性加劇。TFT1的點(diǎn)較為分散，序號(hào)較小的點(diǎn)更靠近NFT的點(diǎn)，序號(hào)較大的點(diǎn)更靠近TFT2的點(diǎn)，進(jìn)一步說明時(shí)長(zhǎng)影響蛋白質(zhì)變性情況。

圖3 最低溫度-20℃下凍融次數(shù)對(duì)DSC曲線影響的雙標(biāo)圖Fig.3 Biplot of effects of different freezing-thawing cycles on DSC curves with the minimum temperature of-20℃

2.4 討論

肉在宰后運(yùn)輸過程中，凍融問題常常發(fā)生，蛋白質(zhì)也因此面臨冷變性而失去活力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的凝膠化特性、與風(fēng)味物質(zhì)的結(jié)合能力以及水合能力發(fā)生改變，最終引起肉持水力下降、風(fēng)味發(fā)生變化、肉的色澤劣變等問題，從而降低肉品質(zhì)。其中，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)因凍融發(fā)生冷變性時(shí)，內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露到外部，降低與水親和的能力，這解釋了凍融次數(shù)增加后TFT2處理組的ΔH4顯著降低的現(xiàn)象[17]；黃鴻兵研究了凍融循環(huán)對(duì)豬肉持水力的影響，發(fā)現(xiàn)隨著凍融次數(shù)的增加，豬肉滴水損失增大[18]，與該實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。冷變性作用和冰晶的形成有關(guān)，速凍形成的冰晶相較緩凍小，對(duì)蛋白質(zhì)的破壞作用也較小，大量的研究證實(shí)了這一點(diǎn)[6-7，19-20]。有研究表明，更快的降溫速率和更低的凍藏溫度有利于肉品質(zhì)的保持，因此，在控制相同DSC儀器降溫速率條件下，作者比較了EFT1組與TFT1組的DSC曲線，結(jié)果表明，相同的降溫速率下，更低的凍融溫度會(huì)加劇蛋白質(zhì)變性，但也能減少凍融和升溫過程羊肉的水分散失。這可能是由于溫度在下降到-20℃之后，溫度繼續(xù)下降，冰晶的生長(zhǎng)仍在進(jìn)行，肉中部分自由水會(huì)向半結(jié)合態(tài)水轉(zhuǎn)變，使得水分在程序升溫過程中蒸發(fā)變少，從而引起EFT1組的ΔH4較TFT1組顯著增大。

肉在加熱過程中蛋白質(zhì)發(fā)生變性，其變性過程反映為DSC曲線的吸熱峰，這些峰的出現(xiàn)是特定溫度范圍下蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)由螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)則卷曲的結(jié)果[21]。一般而言，肌球蛋白熱轉(zhuǎn)變溫度為43～67℃[12]，肌漿蛋白熱轉(zhuǎn)變溫度為67～69℃，肌動(dòng)蛋白熱轉(zhuǎn)變溫度為71～83℃[13]，這3種蛋白質(zhì)受熱發(fā)生變化引起各自溫度范圍中熱吸收峰的出現(xiàn)[22-23]。而在該實(shí)驗(yàn)中，沒有出現(xiàn)肌漿蛋白熱轉(zhuǎn)變峰，這可能是由于肌漿蛋白更易受到凍融影響，在運(yùn)輸和制樣過程中已經(jīng)發(fā)生變性所致。DSC曲線在85℃左右出峰，可能是肌聯(lián)蛋白變性所致[14，24]，只有NFT組出現(xiàn)峰3，可能是肌聯(lián)蛋白在第一次凍融中就已經(jīng)完全變性。此外，肌肉纖維組成的差異和肌肉極限pH可能也會(huì)影響出峰情況，Rozita等利用DSC法研究不同纖維類型牛肉，發(fā)現(xiàn)II型肌肉纖維中肌球蛋白比I型纖維中更容易發(fā)生變性[14]；Rios-mera等利用DSC法研究不同極限pH的牛背最長(zhǎng)肌的蛋白質(zhì)變性溫度，發(fā)現(xiàn)中間范圍的極限pH（極限pH 5.81～6.19）下蛋白質(zhì)變性程度最輕[25]；這兩種影響因素解釋了不同研究中肉在相同溫度區(qū)間里Ton和Tp的偏移。除此之外，影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的因素還有肉的品質(zhì)、加工方式和儲(chǔ)藏條件[26-27]。作者對(duì)同一肉樣切片，控制了以上因素的影響。然而，不同的凍融處理使得Ton和Tp偏移，說明凍融處理會(huì)影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性，且對(duì)不同蛋白質(zhì)的影響程度不同。

肉在解凍過程中容易受到微生物、氧化作用、酶等因素的影響[28-30]，使肉質(zhì)在制樣到測(cè)樣之間的時(shí)間差內(nèi)發(fā)生變化，該實(shí)驗(yàn)中制樣到測(cè)樣之間時(shí)長(zhǎng)與ΔH2呈負(fù)相關(guān)，即與肌動(dòng)蛋白變性程度呈正相關(guān)，表明實(shí)際操作中應(yīng)當(dāng)注意制樣到測(cè)樣之間時(shí)長(zhǎng)對(duì)測(cè)定結(jié)果帶來的影響。陳詠萱等論述了DSC的原理和應(yīng)用，認(rèn)為有機(jī)樣品質(zhì)量在5～10 mg為宜，并且樣品的質(zhì)量越小越好[28]。該實(shí)驗(yàn)中樣品質(zhì)量與各熱焓值相關(guān)性并不明顯，意味著在實(shí)際操作中控制樣品質(zhì)量在適宜范圍內(nèi)后，樣品質(zhì)量對(duì)DSC曲線的影響小。

3 結(jié)語(yǔ)

DSC凍融過程使羊肉的肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白發(fā)生變性，其中肌球蛋白比肌動(dòng)蛋白更易受到凍融處理的影響，且兩者的變性程度都隨著凍融次數(shù)增加而增加；相同降溫速率情況下，-80℃的凍融處理比-20℃的凍融處理增加了肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的變性程度，但前者的水分蒸發(fā)情況較后者更輕；從制樣到測(cè)樣之間的時(shí)長(zhǎng)與肌動(dòng)蛋白變性程度呈現(xiàn)正相關(guān)，時(shí)長(zhǎng)越長(zhǎng)，變性程度越大。總之，凍融處理對(duì)不同蛋白質(zhì)的影響具有差異，利用DSC法可以較為直觀地將這種差異展現(xiàn)出來，但產(chǎn)生這種差異的原因仍不清楚，利用DSC結(jié)合其他技術(shù)，如傅里葉變換紅外光譜可能是一種有效途徑。