ApoA1/2基因多態性與HDL-C水平在老年冠心病心血管死亡與全因死亡中的交互作用研究*

李少君，李 靜，于佳新，張 沛

1.河北省唐山市中醫醫院檢驗科，河北唐山 063000；2.河北省唐山市工人醫院心內科，河北唐山 063000

《中國心血管健康與疾病報告2019概要》[1]顯示，我國冠心病現患病人數達1 100萬，城市、農村病死率分別為115.32/100 000、122.04/100 000，由其導致的心血管死亡與全因死亡成為威脅人民生命健康的首要疾病類型，防治形勢嚴峻，因此對此進行研究意義重大。一項共納入267 500例中國人群的隊列研究隨訪6～19年發現，血脂異常是心血管死亡與全因死亡的相關危險因素，其中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)<1.3 mmol/L時死亡風險明顯增加[2]。臨床工作中應用調脂藥物進行預防，以期降低心血管死亡與全因死亡的風險，但一部分冠心病患者經規范調脂治療HDL-C水平達標后，仍遺留較高的心血管剩余風險[3-4]。近年來有研究發現，遺傳因素與心血管死亡和全因死亡有關[5-6]。載脂蛋白(Apo)A1、ApoA2基因多態性可影響血脂譜及調脂治療療效，并且與冠心病發生有關，由此推測，ApoA1/2基因多態性可影響冠心病患者的預后。基于以上背景，本研究嘗試探討ApoA1/2基因多態性與HDL-C水平在老年冠心病心血管死亡與全因死亡中的交互作用，旨在為其臨床預防不良預后提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2016年1月唐山市中醫醫院收治的385例老年冠心病患者作為研究對象，其中有36例失訪，男164例，女185例，年齡60～82歲，平均(68.09±5.44)歲。根據5年預后情況分為死亡組(61例)和存活組(288例)。兩組患者年齡、性別、體質量指數(BMI)、民族、冠心病病程、疾病類型、美國紐約心臟病學會心功能分級(NYHA分級)、加拿大心臟病學會心絞痛嚴重度分級(CCSC分級)、吸煙、飲酒、合并疾病等一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。納入標準：符合《內科學》第8版冠心病診斷標準[7]；年齡≥60歲；長期在本地居住；自愿參與本研究并簽署知情同意書。排除標準：精神異常、認知障礙等無法配合本研究者；吸毒者；入組前2周有調脂藥物應用史者。

表1 兩組患者一般資料比較或n(%)]

續表1 兩組患者一般資料比較或n(%)]

組別n吸煙否是飲酒否是合并疾病糖尿病高血壓死亡組6143(70.49)18(29.51)47(77.05)14(22.95)25(40.98)19(31.15)存活組288212(73.61)76(26.39)231(80.21)57(19.79)129(44.79)78(27.08)t/χ20.2490.3100.296P0.6180.5780.586

1.2儀器與試劑 全血基因組提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司，批號：252250AX)、PCR試劑盒(美國Genecopoeia公司；批號：CO2011A)、DL2000 DNA Marker(日本Takara公司，批號：D502A)、引物合成(北京擎科新業生物技術有限公司)、全自動生化檢測儀(日本日立公司，760)、離心機(美國Eppendorf公司)、實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司，QuantStudio 6)、微量分光光度計(上海舜宇恒平科學儀器有限公司，752)、電熱恒溫水浴鍋(北京市長風儀器儀表有限公司，HW-SY11-K P2)、全自動生化分析儀(Olympus公司AU400)。

1.3方法

1.3.1生存狀態隨訪 本研究結局包括心血管死亡與全因死亡，根據國際疾病分類第10版(ICD-10)[8]標準，心血管死亡包括缺血性心臟病(ICD-10編碼I20～I25)、腦卒中(ICD-10編碼I60～I69)、其他各種類型的心血管疾病(ICD-10編碼I00～I99)引起的死亡；全因死亡是指隨訪期間因任何一種原因所致的死亡，隨訪方式為電話、微信等，每位患者至少留取3名親屬的聯系方式，隨訪時間5年。

1.3.2一般資料收集方法 采用一般資料調查表收集患者年齡、性別、BMI、民族、冠心病病程、吸煙、飲酒、合并疾病資料，其中BMI=體質量(kg)/身高(m)2，吸煙定義為每日吸煙3支或以上，吸煙史≥6個月，飲酒定義為每周飲酒≥1次，每次折合酒精量>40 g，連續飲酒≥6個月；采用NYHA分級[9]評估心功能，采用CCSC分級[10]評估心絞痛嚴重程度。所有參與調查人員均經過培訓，調查過程遵循《調查員手冊》，確保數據的客觀性，數據錄入時采用雙錄入法，并進行一致性檢驗。

1.3.3ApoA1/2基因多態性及HDL-C水平檢測 (1)入院時采集患者外周靜脈血5 mL，采用全血基因組提取試劑盒提取血細胞基因組DNA，以微量分光光度計對所提取的DNA質量進行鑒定，A260/A280為1.6～1.8符合要求。采用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段的完整性，檢測的基因位點有ApoA1-75G/A、ApoA1+83C/T、ApoA2-256C/T。PCR體系包括引物、4種dNTP、Taq DNA聚合酶、靶序列DNA和PCR反應緩沖液共20 μL。ApoA1-75G/A上、下游引物分別為5′-TTAAGTTCCACATTGCCAGGAC-3′、5′-CCTCCTTCTCGCAGTCTCTAAG-3′；ApoA1+83C/T上、下游引物分別為5′-CTCCCCAGCTCAAGGTTC-3′、5′-ACACCTACCCGTCAGGAAG-3′；ApoA2-256C/T上、下游引物分別為5′-ATCAGCATCCAGGTCATTC-3′、5′-AGGAGAGGACAAGCACAT-3′。反應條件95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，30個循環，最后72 ℃延伸5 min，150 V電泳15 min后取出凝膠，紫外線投射儀上觀察結果。(2)采用全自動生化分析儀檢測血清HDL-C水平。

2 結 果

2.1隨訪結果 385例老年冠心病患者隨訪5年，36例(9.35%)失訪，349例(90.65%)有完整隨訪資料。獲訪患者中共有61例死亡，其中36例死于心血管疾病，包括腦卒中14例，缺血性心臟病16例，其他各種類型的心血管疾病6例。

2.2兩組患者ApoA1/2基因多態性與HDL-C水平比較 基因分型檢測結果顯示，ApoA1-75G/A基因型：GG、GA、AA；ApoA1+83C/T基因型：CC、CT、TT；ApoA2-256C/T基因型：CC、CT、TT；PCR擴增目的片段后，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，選擇條帶清晰的擴增產物15 μL進行基因測序驗證。采用BioEdit version5.0.6軟件查看測序結果，證實ApoA1-75G/A、ApoA1+83C/T、ApoA2-256C/T均存在多態性。兩組患者基因型頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，具有人群代表性(P>0.05)。兩組患者ApoA1-75G/A基因型與等位基因分布比較，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組患者ApoA1+83C/T、ApoA2-256C/T基因型與等位基因分布比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；死亡組患者HDL-C水平低于存活組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者ApoA1/2基因多態性與HDL-C水平比較[n(%)或

組別nApoA2-256C/T基因型CCCTTTApoA2-256C/T等位基因CTHDL-C(mmol/L)死亡組6156(91.80)4(6.56)1(1.64)116(95.08)6(4.92)1.05±0.19存活組288256(88.89)27(9.38)5(1.74)539(93.58)37(6.42)1.32±0.14χ2/t0.5010.39512.784P0.7790.530<0.001

2.3不同ApoA1-75G/A基因型患者HDL-C水平比較 ApoA1-75G/A基因型AA患者HDL-C水平為(1.58±0.10)mmol/L，高于基因型GA患者的(1.40±0.11)mmol/L和基因型GG患者的(1.24±0.13)mmol/L，差異均有統計學意義(F=75.915，P<0.001)。ApoA1-75G/A基因型AA患者、基因型GA患者和基因型GG患者HDL-C水平兩兩比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.4心血管死亡與全因死亡的多因素Logistic回歸分析 將心血管死亡與全因死亡作為結局變量，納入兩組比較P<0.05的資料作為自變量，多因素Logistic回歸分析結果顯示，ApoA1-75G/A基因型GA、AA及HDL-C均是心血管死亡與全因死亡的影響因素(P<0.05)。見表3。

表3 心血管死亡與全因死亡的多因素Logistic回歸分析

2.5ApoA1-75G/A基因多態性與HDL-C水平對心血管死亡與全因死亡的交互作用 單獨HDL-C水平降低所致的OR為5.691，單獨ApoA1-75G/A基因突變所致的OR為0.400，二者同時存在時，交互作用的OR為5.333，且γ為0.931，提示ApoA1-75G/A基因型GA、AA與HDL-C降低在心血管死亡與全因死亡中呈負向交互作用，即ApoA1-75G/A基因突變對心血管死亡與全因死亡的相關因素HDL-C水平降低的效應具有減弱作用；同時5.333>5.691×0.400，則ApoA1-75G/A基因突變與HDL-C水平降低交互作用符合超相乘模型。見表4。

表4 ApoA1-75G/A基因多態性與HDL-C因素對心血管死亡與全因死亡的交互作用

3 討 論

目前，關于血脂與老年冠心病發病、病情嚴重程度及預后的報道較多，已明確血脂代謝異常在心血管死亡與全因死亡中起消極作用，但血脂指標較多，既往報道常集中于甘油三脂和低密度脂蛋白，關于HDL-C的研究較少。本研究發現，死亡組患者HDL-C水平低于存活組，提示HDL-C水平與老年冠心病患者心血管死亡和全因死亡有關。李明卓等[11]研究顯示，在血脂水平正常人群中，HDL-C水平縱向升高是冠心病的獨立保護因素。HDL-C具有抗動脈粥樣硬化作用，可將膽固醇從肝外轉運至肝臟進行代謝，故HDL-C水平降低患者在長期生活中發生動脈粥樣硬化的危險度增加，從而增加缺血性心臟病、腦卒中等的發病風險[12]。

ApoA1/2是與HDL-C密切相關的載脂蛋白類型，其中ApoA1可激活卵磷脂-膽固醇酰基轉移酶，促進膽固醇釋放，是膽固醇逆向轉運過程的核心組分；ApoA2對膽固醇的影響目前尚存爭議，部分觀點認為，ApoA2可強化HDL-C保護低密度脂蛋白被氧化的功能，預防動脈粥樣硬化發生[13]。部分資料顯示，ApoA2不利于HDL-C的轉運和抗氧化作用，促進動脈粥樣硬化發展[14]。本研究發現，兩組患者ApoA1+83C/T、ApoA2-256C/T基因型與等位基因分布比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，提示ApoA1+83C/T、ApoA2-256C/T基因多態性與心血管死亡和全因死亡無關。兩組患者ApoA1-75G/A基因型與等位基因分布比較，差異有統計學意義(P<0.05)，表明ApoA1-75G/A基因多態性與心血管死亡和全因死亡有關。且ApoA1-75G/A基因型AA患者HDL-C水平高于基因型GA患者和基因型GG患者，說明攜帶A等位基因的冠心病患者HDL-C水平較高。DE LUIS等[15]研究發現，ApoA1-75G/A基因多態性與飲食誘導的胰島素抵抗有關，并獲得了A等位基因攜帶者在低熱量飲食后HDL-C水平升高的額外證據，本研究的觀點與之存在相似之處。另一項研究顯示，ApoA1-75G/A與代謝綜合征有關，未攜帶A等位基因的男性表現出高比例向心性肥胖、低水平HDL-C和高血糖，而肥胖、低水平HDL-C和高血糖均可導致動脈粥樣硬化，引發心血管死亡[16]。PANDITH等[17]研究顯示，ApoA1-75G/A基因型在發生急性心肌梗死與未發生急性心肌梗死患者中比例相似，與急性心肌梗死無關，本研究結論與之不一致，一方面可能是因為種族、國度不同；另一方面是以急性心肌梗死為結局事件。本研究是以全因死亡與心血管死亡為結局事件，可能導致了研究結論不同，仍需后續納入多種族、多國度人群進行進一步驗證。

在以上研究基礎上本研究還發現，ApoA1-75G/A基因型GA、AA與HDL-C水平降低在心血管死亡與全因死亡中呈負向交互作用，即ApoA1-75G/A基因突變可減低因HDL-C水平降低對心血管死亡與全因死亡的影響效應，ApoA1-75G/A基因突變與HDL-C水平降低的交互作用符合超相乘模型。分析其原因發現，ApoA1-75G/A基因位于ApoA1基因啟動子區的第75個堿基，相對于野生GG基因型，突變雜合子與突變純合子中的A等位基因可能影響了轉錄因子與啟動子的識別，使ApoA1基因轉錄活性降低，抑制了動脈粥樣硬化的進程，進而對老年冠心病心血管死亡與全因死亡起保護作用，但其確切的機制需要更為系統和深入的研究證實。本研究也有一定局限性，如樣本量小，研究對象人群來源國度單一，可能造成統計數據偏倚，縮小了研究成果適用范圍，仍需后續多中心、多國度隨機對照研究進一步驗證。

綜上所述，ApoA1/2基因多態性、HDL-C水平均與老年冠心病患者心血管死亡與全因死亡有關，且ApoA1-75G/A基因突變可減低因HDL-C水平降低對心血管死亡與全因死亡的影響效應，呈現出預后保護作用。