miRNA在膿毒癥病原微生物診斷中的研究進展*

孫文杰，張國安，楊曉暉 綜述，劉英富,2△ 審校

1.滄州醫學高等專科學校，河北滄州 061000；2.滄州市納米抗體技術創新中心，河北滄州 061000

最新國際共識對膿毒癥的定義為機體對感染的反應失調而導致危及生命的器官功能障礙性疾病[1]。膿毒癥是一個全球性公共衛生問題，是感染導致死亡的主要原因。膿毒癥每年新增病例高達1 900萬，病死率大于25%[2]，據統計約一半的病死率是由繼發性感染引起的[3]。膿毒癥確診后應盡快啟動抗菌藥物治療，每延遲1 h，病死率就會明顯升高[4]。近年來，抗菌藥物的濫用導致細菌耐藥性問題愈演愈烈，抗菌藥物的合理使用急需臨床早期快速的膿毒癥診斷和病原學檢測。膿毒癥的病原微生物90%以上為細菌[5]，除此之外還有真菌、病毒及其他微生物。長期以來，通過血培養技術檢測到病原微生物被視為診斷膿毒癥的金標準[6]，但其臨床應用仍存在培養周期長、工作量大、靈敏度低、有假陰性風險等缺點。目前常用的膿毒癥生物學診斷指標有降鈣素原、可溶性CD14亞型、C反應蛋白、白細胞介素-6、脂多糖結合蛋白等，均存在特異性有限，且無法提供致病微生物信息的缺點。正常情況下，小分子RNA(miRNA)在人體液中保持穩定，而疾病狀態下miRNA呈現出差異性表達的特點，這對膿毒癥的診斷具有重要意義。近年來，miR-25、miR-122、miR-133a、miR-150、miR-233等[7]在膿毒癥的生物標志物研究領域均取得了一定進展。通過miRNA檢測感染微生物的類型，提高膿毒癥診斷的特異性，從而改善膿毒癥的診療策略，具有重要研究意義和臨床價值。

1 miRNA的特征

miRNA是一類由21～25個核苷酸組成的小分子非編碼RNA，主要通過靶向mRNA抑制其轉錄后翻譯或降解mRNA，使基因沉默發揮調控作用[8]。也有少部分miRNA能夠誘導轉錄或上調蛋白的表達[9]。miRNA在生物體中廣泛存在，至今已被發現有高達數萬種，僅人類基因組中就已發現2 000～3 000種miRNA。miRNA在細胞質中合成，然后通過核糖體蛋白復合物、細脂質囊泡、外泌體等形式釋放到細胞外，不被RNA酶消化，在血漿、血清、尿液、唾液、精液等體液中可穩定存在[10]。循環miRNA具有穩定性高、特異性強、化學結構簡單、無轉錄后修飾、易獲得、可反復凍融和長期保存、便于快速檢測等優點[10]，在疾病診斷方面具有成為理想生物標志物的潛力。miRNA以囊泡轉運或蛋白載體機制被細胞輸出或輸入，介導不同組織間的通訊，從而調節遠端細胞功能，參與調節多種生理和病理過程的發生和發展。

2 miRNA與膿毒癥相關的生物學功能

膿毒癥的發病機制復雜且尚不明確，除了病原微生物及其毒素的直接損傷作用外，感染還能夠導致機體處于炎癥激活和免疫功能紊亂狀態，進而發展為器官功能障礙，以致危及生命。微生物感染主要通過宿主Toll樣受體(TLR)識別革蘭陰性菌(GNB)的脂多糖(LPS)或革蘭陽性菌(GPB)的脂磷壁酸(LTA)兩種信號轉導途徑觸發病原體與宿主之間復雜的相互作用。病原體刺激機體后，miRNA異常表達，通過介導細胞間信息傳遞調控基因表達，從而調控多種細胞的增殖、分化和凋亡，對炎癥反應、免疫反應及器官組織損傷等發揮調控作用。生物體內存在多種miRNA，能夠廣泛參與各種細胞的活動，涉及多條信號通路。有研究報道顯示，在膿毒癥中miR-181a對TLR信號傳導通路起負反饋調節作用，并且能夠調節炎癥細胞因子產生[11]。miR-125b可調節膿毒癥中內皮細胞的功能和血管屏障作用，從而減輕組織器官損傷[12]。miR-146和miR-125通過參與膿毒癥先天免疫應答信號的調節，調控炎癥反應及機體的抗感染功能[13]。在膿毒癥中miR-31表達下調，可促進CD4+T淋巴細胞向Th2表型轉化，從而促進其從高炎癥狀態到免疫抑制狀態的轉變[14]。所以，膿毒癥發生和發展的各個階段幾乎都涉及miRNA的調控作用。

3 miRNA可作為膿毒癥診斷的生物標志物

膿毒癥的非特異性臨床表現導致診斷延遲一直是醫學研究的熱點問題。正常生理條件下，miRNA在人外周循環中保持穩定，而在膿毒癥患者體液中呈現差異性表達，因此，檢測患者體液中miRNA水平可起到預測或診斷膿毒癥的作用。近年來有研究證實，miRNA可作為膿毒癥的潛在生物標志物[7]，還可特異性檢測膿毒癥導致的臟器損傷[15]，區分膿毒癥的嚴重程度[7]，以及鑒別感染的病原微生物類型[16-18]。通過miRNA檢測病原菌類型，聯合其他生物學指標，可提高膿毒癥診斷的特異性，為膿毒癥早期抗感染策略提供依據。

3.1miRNA與GNB性膿毒癥的診斷 導致膿毒癥的常見GNB包括大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等。近年來，已發現多種miRNA在GNB感染致膿毒癥中的差異性表達。在不同GNB(大腸埃希菌、肺炎桿菌、綠膿桿菌、沙門菌、沙雷菌)來源的LPS誘導小鼠感染模型中均檢出了let-7d、miR-15b、miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107和miR-451這8種miRNA特異性差異表達，可能是LPS感染的潛在標志物。在細菌感染與盲腸結扎穿刺(CLP)致膿毒癥模型的對比研究中，大腸埃希菌組中有let-7i/7d、miR-16、miR-20a、miR-26a/26b、miR-106a/106b、miR-451等在24 h內表達上調2倍以上，且CLP致膿毒癥以GNB感染為主[16]。在GNB感染泌尿系統的膿毒癥患者中，miRNA-150和let-7a表達水平明顯降低，可能是GNB感染泌尿系統致膿毒癥的潛在生物標志物[17]。在大腸埃希菌、類鼻疽菌、土拉桿菌感染的人外周血單核細胞模型中，miR-30-5p均出現顯著性差異表達[18]，也可能是GNB感染的潛在標志物。此外，還有些miRNA在特定GNB感染中呈差異性表達，可能與其特異性感染相關。在大腸埃希菌感染牛乳腺上皮細胞中的miRNA分析表明，miR-18、miR-24-3p、miR-148、miR-486、let-7a-5P具有大腸埃希菌特異性[19]。綠膿桿菌感染會引起miR-302b、miR-301b、miRNA-155、let-7、miRNA-233等表達變化，其中miR-301b可作為靶點調控感染引起的炎癥反應和先天免疫應答[20]。布魯菌感染會引起let-7b、miR-92a、miR-93、miR-181b、miR-1981水平明顯變化[21]。在沙門菌感染情況下，miRNA-146的表達水平發生明顯變化，而且在先天免疫調節中發揮作用[22]。不同GNB感染致膿毒癥可能存在共同的生物標志物，如let-7a/7d、miR-16、miR-150、miR-30-5p等，而不同的GNB感染還可能具有其特異性的生物標志物，尚需研究加以驗證。

3.2miRNA與GPB性膿毒癥的診斷 GPB致膿毒癥以金黃色葡萄球菌(SA)、腸球菌、表皮葡萄球菌等為主，而miRNA作為其生物標志物的研究也取得了一定進展。在枯草桿菌、糞鏈球菌和SA來源的LTA分別誘導小鼠感染模型的對比研究發現，miR-451、miR-668、miR-1902和miR-1904表達均明顯上調，并且呈劑量和時間依賴性，可能成為LTA感染的潛在生物標志物[23]。WU等[16]研究發現，在SA感染致膿毒癥模型中，miR-133a/133b、miR-122、miR-205、miR-1899、miR-714、miR-291b的血清水平與SA特異性相關。RAU等[24]在大腸埃希菌和SA感染模型的對比研究中發現，miR-193b-3p、miR-133a-1-3p和miR-133a-2-3p是SA感染最常見的miRNA靶標，也有可能成為GPB感染的特異性標志物。還有些miRNA在特定GPB感染中呈差異性表達，可能與其感染特異性相關。在SA感染牛乳腺上皮細胞模型中檢測出miR-2339、miR-499、miR-23a、miR-99b這4種miRNA與SA感染特異性相關[19]。李斯特菌感染后，miRNA-146、miRNA-155、miR-125a-3p/5p、miR-149呈顯著差異表達，并且可能參與固有免疫應答調節[25]。不同GPB感染致膿毒癥也可能存在共同的生物標志物，如miR-133a、miR-668、miR-1902、miR-1904等，而不同GPB感染還具有其特異性生物標志物，有待進一步研究。

3.3miRNA與病毒感染的診斷 病毒致膿毒癥的高發人群主要是免疫力低下人群。有研究報道顯示，42.7%的膿毒癥患者存在兩種及兩種以上的病毒感染[26]，包括流感病毒、腺病毒、腸道病毒、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)等[27]。TUDOR等[28]通過對比膿毒癥患者和健康者的白細胞miRNA表達譜發現，miR-K-10b和miR-K12-12的表達水平特異性顯著上調，能夠通過靶向TLR8促進白細胞介素(IL)-6和IL-10分泌，參與膿毒癥的發展。在手足口病患者血清中發現6種miRNA，包括miR-148a、miR-143、miR-324-3p、miR-628-3p、miR-140-5p、miR-362-3p，具有腸道病毒特異性，有助于區分腸道病毒與其他微生物[29]。LI等[30]在VZV感染患者的循環miRNA分析中發現了6種miRNA，包括miR-190b、miR-571、miR-1276、miR-1303、miR-943、miR-661，其表達水平明顯上調，可能成為VZV感染的生物標志物。還有研究顯示，miR-34/449 家族包括miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-449a、miR-449b 和 miR-449c，能夠參與免疫反應和病毒感染的調節[31]，有可能成為病毒感染診斷和治療的新靶點。

3.4miRNA與真菌感染的診斷 膿毒癥的真菌病原體以念珠菌為主，而念珠菌感染通常與長期服用抗菌藥物、植入異物、免疫力低下和慢性病等有關。MUHAMMAD等[32]在念珠菌感染的呼吸道上皮細胞miRNA表達譜分析中發現，miR-16-1明顯上調，而miR-17-3p明顯下調。WU等[33]在白色念珠菌感染的巨噬細胞模型中發現，miR-140-5p表達上調，而miR-223-3p表達下調，且參與免疫反應、炎癥反應和細胞凋亡的過程。MARIOTO等[34]研究發現,miR-let-7f-5p、miR-let-7a-5p、miR-5p-26b、miR-let-7e-5p、miR-369-3p、miR-466k 在小鼠肺部感染巴西芽生菌后表達水平明顯增加，可能參與了巴西芽生菌感染期間的免疫反應。還有研究顯示，通過miRNA檢測可有效區分口腔上皮細胞感染的高致病性或低致病性念珠菌類型[35]，提示miRNA對不同類型的真菌感染檢測也具有重要意義。

此外，有研究證實，在多種寄生蟲感染性疾病中也已發現miRNA的差異性表達[34-35]。miRNA作為生物標志物有望用于區分不同的病原微生物感染，優化抗感染策略及監測患者對抗感染藥物治療的反應。

4 小 結

綜上所述，大量研究已證實，多種miRNA的差異性表達與感染的病原微生物特異性相關，可能作為膿毒癥致病微生物診斷的潛在生物標志物[34-35]，對GNB、GPB、病毒、真菌等的特異性檢測具有重要意義。目前研究結果之間存在重大差異，可能是因為研究多在重癥監護病房或動物實驗中進行，研究設計和實驗標本等存在差異，患病時長的差異也會在數據中產生干擾。miRNA檢測方法與研究方法的標準化及miRNA水平的縱向研究將提供膿毒癥進程中miRNA的表達信息，可能會解決一些矛盾。盡管目前miRNA與膿毒癥的發病機制、診斷與治療中的作用尚不明確，仍處于研究的初期階段，但是已經越來越受到科研人員和臨床人員的關注，越來越多的特異性miRNA被發現在膿毒癥診斷中具有重要作用。隨著大量研究和調控機制的明確，miRNA可能會成為新型的膿毒癥診斷標志物及快速、準確檢測致病微生物，快速啟動定向治療，檢測抗感染療效，改善患者預后，降低病死率，優化膿毒癥的診療策略。