基于傾向性評分匹配探討載脂蛋白E水平及其基因多態性與腦血栓形成的相關性分析*

黃 杰，黃華玲，王 鵬，謝東德， 李海燕 ， 董少文

1.南方醫科大學附屬佛山醫院檢驗科，廣東佛山 528000；2.海南醫學院熱帶醫學與檢驗醫學院，海南海口 571199；3.南方醫科大學附屬佛山醫院神經內科，廣東佛山 528000

在我國住院的急性腦卒中患者中，3個月內病死率為9.0%～9.4%，致殘率為34.5%～37.1%[1]。在腦卒中的發病常見因素中，約60%是因腦血栓形成導致。腦血栓是一種在腦血管內淤血、凝血傾向增加、腦血管管壁自身病變及腦血管血流減慢情況下，血液中的紅細胞、纖維蛋白和血小板附著在血管壁上而形成的血栓，是由多種因素影響造成的疾病。有研究表明，腦血栓形成的危險因素包括高血壓、高脂血癥、高膽固醇、高血糖及部分血清載脂蛋白(Apo)標志物等[2]。ApoE是一種參與調節脂質代謝的多態性脂蛋白，ApoE基因可通過產生多態性蛋白，參與脂蛋白的轉化和代謝過程，其基因多態性決定血脂水平，與許多腦血管病的發生和發展相關[3]。目前，雖已有部分關于ApoE基因多態性或ApoE水平與腦血栓形成的相關性研究，但很少有文獻同時分析ApoE水平及其基因多態性與腦血栓形成的相關性。而且由于腦血栓形成的危險因素較多，容易造成混雜變量偏倚及數據偏差，導致部分專家與學者的研究結果不盡相同。傾向性評分匹配(PSM)已廣泛應用于觀察及臨床非隨機化數據的研究，根據PSM得出與實驗組混雜影響因素分布均勻的對照組，從而減少偏倚[4]。本研究旨在探討ApoE水平及其基因多態性與腦血栓形成的相關性，為保證研究結果更具科學性及客觀性，采用PSM方法，能夠在設計和分析階段有效平衡對照研究中與腦血栓形成相關危險變量的偏倚，從而獲得ApoE各基因型與腦血栓形成的客觀相關性數據，以及各基因型對應的血清ApoE水平，探討ApoE水平及其基因型是否可作為用于監測及早期評估腦血栓形成的新標志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年12月至2021年1月在南方醫科大學附屬佛山醫院神經內科門診擬診為早期腦血栓形成的312例患者作為研究對象，對其進行評估并隨訪6個月，根據隨訪期間再次就診情況，結合臨床癥狀及影像學診斷結果，將疑似患者分為腦血栓組(144例)和對照組(168例)。其中男148例，女164例。納入標準：符合文獻[5]的相關診斷標準，包括：(1)臨床癥狀，表現為頭暈、乏力、肢體麻木、感覺障礙、構音障礙、意識障礙等；(2)神經專科檢查，包括病理反射陽性，腹壁及提睪反射減弱或消失；(3)采用美國國立衛生研究院卒中量表對腦梗死進行評分，分數越高表示腦梗死對神經系統的影響程度越大；(4)顱腦CT血管造影(CTA)、磁共振成像(MRI)結果提示相關腦梗死責任病灶信息，CTA明確有關血管閉塞或狹窄信息，多模式MRI[包括彌散加權成像(DWI)、灌注加權成像(PWI)]：DWI發現缺血灶，確定病灶大小、部位，PWI顯示腦血流動力學改變。排除標準：(1)不愿意配合醫學觀察研究的患者；(2)有心、肝、腎功能異常的患者；(3)有血液感染、中樞神經系統感染、腦出血、腦腫瘤的患者。高血壓判斷標準則參照《中國急診高血壓診療專家共識(2017修訂版)》[6]進行診斷及高血壓級別分型。糖耐量異常的診斷標準參照文獻[7]執行。收集記錄患者首次就診時的實驗室檢查項目數據：甘油三脂(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、ApoA、ApoB、D-二聚體(D-D)、纖維蛋白原(FIB)、空腹葡萄糖(Glu)、ApoE及ApoE基因型等。

1.2方法 血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、Glu、ApoA、ApoB、ApoE等項目采用全自動生化分析儀(邁瑞6000i)檢測，前5項檢測方法分別為膽固醇氧化酶法、選擇性清除法、過氧化物酶清除法、免疫化學沉淀法、葡萄糖氧化酶法，后3項檢測方法均為免疫透射比濁法。檢測標本均為患者首次就診時抽取的血液標本。標本前處理先使用含有促凝劑和惰性分離膠的真空采血管，將抽取的血液標本置于低速離心機以5 000 r/min離心5 min，并在2 h內完成檢測。D-D與FIB則采用日本Sysmex CS 5100全自動凝血儀進行檢測，檢測方法分別為免疫比濁法和凝固法。D-D與FIB的血液標本為使用枸櫞酸鈉抗凝后的靜脈外周血血漿，血液標本抽取時間與處理原則與生化標本相同。ApoE基因檢測通過留取以乙二胺四乙酸二鉀抗凝的靜脈血，在破碎細胞后，先以柱提法洗脫提純目的基因，然后采用熒光定量PCR檢測得到目的基因型別。以上所有檢測項目及檢測過程均嚴格按照各儀器標準操作規程進行操作，以保證結果的準確性。

2 結 果

2.1腦血栓組和對照組PSM前、后基線資料比較 研究對象共312例，其中腦血栓組144例，對照組168例。腦血栓組和對照組PSM前基礎資料，如性別、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、HDL-C、ApoB、Glu等比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。采用PSM對兩組基礎資料進行1∶1近似PSM后成功匹配87對，各協變量均衡性得到提高，兩組基礎資料差異減小，均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表2。

表1 腦血栓組和對照組PSM前一般資料比較[n(%)或或P25/P50/P75]

表2 腦血栓組和對照組PSM后一般資料比較[n(%)或或P25/P50/P75]

組別nHDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)ApoA(g/L)ApoB(g/L)Glu(mmol/L)FIB(g/L)D-D(g/L)腦血栓組1441.04±0.253.26±1.131.18±0.201.02±0.277.35±2.853.54±1.390.40/0.69/0.99對照組1681.15±0.273.04±1.051.17±0.160.94±0.266.29±1.863.31±0.980.27/0.76/0.94χ2/t/Z3.6131.7570.4622.0503.7811.600-1.535P0.0430.0800.6380.0150.0180.1110.125

續表2 腦血栓組和對照組PSM后一般資料比較[n(%)或或P25/P50/P75]

2.2腦血栓組和對照組ApoE基因型和基因攜帶分布情況比較 經PSM成功后的87對數據中，腦血栓組主要以ε3ε3、ε3ε4及ε4ε4 3種ApoE基因型組成，而對照組主要由ε2ε3、ε3ε3和ε3ε4 3種ApoE基因型組成。腦血栓組ε3ε4及ε4ε4基因型頻率明顯高于對照組，ε2ε3基因型頻率明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；腦血栓組和對照組ε2ε2、ε2ε4和ε3ε3基因型頻率差異均無統計學意義(P>0.05)。腦血栓組攜帶ε4基因頻率明顯高于對照組；攜帶ε2基因頻率明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 腦血栓組和對照組ApoE基因型和基因攜帶率分布情況比較[n(%)]

2.3不同ApoE基因型在腦血栓組和對照組中ApoE水平比較 經過PSM成功后的87對數據中，不同ApoE基因型腦血栓組對應的ApoE水平均明顯高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，高水平ApoE可能是腦血栓形成的獨立危險因素；無論是腦血栓組還是對照組，攜帶一個或超過一個ε4基因(≥1個ε4)時，其對應的ApoE水平均明顯高于其他基因型，差異均有統計學意義(P<0.05)，ε4基因型是ApoE的高危基因型。見表4。

表4 不同ApoE基因型在腦血栓組和對照組中ApoE水平比較

3 討 論

腦卒中是全球第二大死亡原因，也是致殘的主要原因，而腦血栓形成是腦卒中最常見的發病原因，占全部腦卒中的60%左右[8]。急需通過早期、快速、全面檢查和評估來預測腦血栓形成的風險，并盡早進行臨床干預及治療，有助于做好疾病的一級預防。然而，臨床上常規顱腦MRI檢查評估并無法明顯提高早期腦血栓形成的診治效率，因為嚴格的急性腦梗死診治定義與影像學檢查結果本身就密不可分[9]。所以，想要在早期對急性腦梗死進行病情惡化的可能性預測，需要更多的實驗室診斷技術加以實現。目前，在與腦血栓形成相關的研究領域，有關ApoE的研究正逐步成為新的熱點。有研究表明，血清ApoE是腦血栓形成的危險因子， ApoE基因多態性與腦血栓的形成存在相關性，但是與腦血栓形成相關的危險因素較多，包括血壓、血脂、血糖及機體血液的高凝狀態，以及血管本身的病變等[10]，并且各因素之間也存在相互影響。有研究表明，攜帶ApoE-ε4基因型的腦卒中患者TC和LDL-C水平均明顯高于攜帶ε2和ε3基因型的患者，得出ApoE基因多態性與缺血性腦卒中發病存在關聯[11]。 但是，血脂水平早已被證實是腦血栓形成的危險因素之一[12]。究竟是血脂的總體水平導致了腦血栓形成的風險，還是其中的ApoE基因型起到決定性作用?為解決這個變量間偏倚的問題，本研究采用PSM方法，在實驗設計和分析階段有效平衡對照研究中與腦血栓形成相關危險變量的偏倚，以便提高ApoE基因與腦血栓形成相關性研究結果的準確性及可信度。

ApoE基因主要通過影響脂蛋白對脂類的轉運而影響血脂水平。ApoE基因包括3種基因亞型(ε2、ε3、ε4)和6種表型(ε2 ε2、ε2 ε3、ε2 ε4、ε3 ε3、ε3 ε4、ε4 ε4)[13]。本研究結果顯示，腦血栓組ε3ε4及ε4ε4基因型頻率明顯高于對照組，也就是說腦血栓組攜帶ε4基因的頻率明顯高于對照組，這與SMITH[14]的研究結果一致。脂質代謝基因影響動脈粥樣硬化形成的病理過程[15]，ε4基因是導致動脈粥樣硬化的獨立危險因素，與個體血漿TC水平升高及心腦血管病的發生具有相關性[16]；相反，ε2基因能夠降低血漿TC水平[17]，從而降低腦血栓形成的風險。CHOWDHURY等[18]的研究證實，ε2和ε4基因所產生的蛋白質產物具有對脂蛋白的分離和反向影響。所以，本研究對照組攜帶ε2基因頻率更高，具有準確性及科學性。而攜帶ε3基因頻率在兩組間的差異無統計學意義(P>0.05)，主要是因為ε3基因最為常見，并且其產生的ApoE多態性脂蛋白被認為并不是高風險的脂蛋白[19]。

李秀鋒等[20]研究發現，ε4基因的存在會影響血清中脂蛋白水平。本研究通過分析腦血栓組和對照組不同基因型所對應的ApoE水平發現，無論是腦血栓組還是對照組，攜帶ε4基因型時，其對應的ApoE水平均高于其他基因型，同樣證實了ε4基因影響血清ApoE水平。此外，腦血栓組不同ApoE基因型對應的ApoE水平均明顯高于對照組同種基因型，也就是說腦血栓患者血清中ApoE水平更高，這與黃柳等[21]的研究結果一致。有研究結果提示，動脈粥樣硬化嚴重程度與ApoE啟動子多態性可能存在聯系，參與調控ApoE轉錄的過程。此外，腦梗死患者血清ApoE水平明顯增高，除含有高危基因(ε4基因)外，還可能與神經源性ApoE增加有關[22]，具體機制可能與MTHFRC677T基因多態性有關。

綜上所述，本研究采用PSM對研究過程中的混雜因素與數據偏倚進行有效平衡后，得出ApoE水平及其基因多態性與腦血栓的形成有關。腦血栓形成患者血清ApoE水平明顯升高，通過監測血清ApoE水平變化可用于早期評估腦血栓形成的風險；而ε4是ApoE的高危基因型，其對應的血清ApoE水平增加幅度明顯高于ε2和ε3基因型。所以，同時監測ApoE水平及其基因多態性，對輔助腦血栓形成的早期診治及預防具有較大的臨床應用價值。