高效液相色譜法測定維生素D3的三個標準方法比較

秦天琦,吳愫青（廣東省珠海市食品藥品檢驗所,廣東 珠海 519090）

碳酸鈣D3片為復方制劑，含有碳酸鈣和維生素D3兩種主要的有效成分。鈣元素是維持人體神經、肌肉、骨骼系統、細胞膜和毛細血管通透性等正常生理功能所必需的。維生素D3是自然存在的一種脂溶性維生素，屬于類固醇類激素，維生素D3的基本功能是參與體內鈣、磷代謝，促進腸道鈣、磷吸收，調整鈣、磷吸收比例，促進骨的鈣化和正常發育[1]。碳酸鈣D3片臨床上主要用于妊娠和哺乳期婦女、更年期婦女、老年人等的鈣補充，并用于預防與治療佝僂病、中老年骨質疏松癥，另有文獻報道維生素D3對老年高血壓亦有協同治療作用[2]。

因制劑中維生素D3含量較低，準確測定制劑中維生素D3的含量尤為重要，目前已有的三個標準：《國家食品藥品監督管理局標準YBH05962009》《國家食品藥品監督管理局國家藥品標準WS1-(X-002)-2008Z-2012》《GB 5009.82-2016食品安全國家標準 食品中維生素 A，D，E的測定》，均對如何提取分離并準確測定制劑中的維生素D3作了相關的規定，本文參考三個標準的規定，分別采用萃取后真空旋蒸至干復溶法、有機溶劑提取法、皂化法三種方法提取分離碳酸鈣D3片中的維生素D3，然后分別采用反相高效液相色譜法、正相高效液相色譜法、在線固相萃取-二維液相色譜方法三種方法測定維生素D3的含量。

1 儀器與試藥

1.1試劑與藥品 藥品：碳酸鈣D3片（北京振東康遠制藥有限公司提供；批號：20201056），對照品：維生素D3（中檢院提供，批號：100061-201208，含量：99.8%，干燥：無），試劑：異丙醇、氨水、無水乙醇、環己烷、無水硫酸鈉、氯化鈉、乙腈（HPLC）、甲醇（HPLC）、二甲基亞砜、正己烷（HPLC）、異丙醇（HPLC）、抗壞血酸、2,6-二叔丁基對甲酚（簡稱BHT）、氫氧化鉀。

1.2儀器與色譜柱 儀器：電子分析天平（METTLER TOLEDO XPE206DR）；超高效液相色譜儀（Agilent 1260 prime）；高效液相色譜儀（Agilent 1260）；超聲波清洗器（Elma P300H）；水浴鍋（Julabo CORIO CD）；低速臺式離心機（Anke TDL-50C）；旋轉蒸發儀（IKA RV10 Auto pr）。

色譜柱：反相色譜法色譜柱：Welch Ultimate LP-C18，4.6×150mm，5μm，SN：60201 201105；正相色譜法色譜柱：Welch Ultimate SiO2，4.6×250mm，5μm，SN：60210 301071；在線固相萃取-二維液相色譜方法色譜柱：SPE柱：Agilent PLRP-S，4.6×12.5mm，15-20μm（5982-1270）；1D分析柱：Agilent Poroshell 120 EC-C8，4.6×100mm，4 μm（695970-906）；捕獲柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18，4.6×5mm，4 μm（820750-916）；2D分析柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus PAH，2.1×100mm，3.5 μm（959793-918）。

2 實驗部分

2.1提取分離維生素D3

2.1.1萃取后真空旋蒸至干復溶法 系統適應性試驗：維生素D3峰與前維生素D3峰的分離度應符合規定。

前維生素D3相對校正因子測定：避光操作。取維生素D3對照品約20mg，精密稱定，置200ml量瓶中，加異丙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備溶液，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加異丙醇至刻度，搖勻；另精密量取對照品貯備溶液5ml，置250ml回流瓶中，加異丙醇20ml，于95℃水浴中回流1小時，40℃真空旋轉蒸發至干，精密加入異丙醇100ml，振搖使溶解。精密量取上述二種溶液各20μl注入液相色譜儀中，計算前維生素D3折算成維生素D3的相對校正因子（f=(A1-A2)/(A3-A4)）。

式中：A1為熱破壞前維生素D3的峰面積；A2為熱破壞后維生素D3的峰面積；A3為熱破壞后前維生素D3的峰面積；A4為熱破壞前前維生素D3的峰面積。

供試品溶液：避光操作。取本品1片，置250ml具塞量筒中，加0.3%氨水溶液，振搖使崩解，置90℃-100℃水浴中，加熱振搖15秒，取出，具塞，振搖45秒，再重復上述操作2次。加無水乙醇至60ml，振搖10秒鐘，精密加入環己烷100ml，振搖1分鐘，加水50ml，振搖2分鐘，靜置使分層（若乳化，可加入氯化鈉適量破乳），取環己烷層，經無水硫酸鈉濾過，精密量取續濾液50ml，置150ml回流瓶中，40℃真空旋轉蒸發至干，精密加入異丙醇2ml，振搖使溶解。

對照品溶液：精密稱取維生素D3對照品適量，加異丙醇溶解并定量稀釋制成每1ml中約50IU的溶液，同法測定。

2.1.2有機溶劑提取法 系統適應性試驗：維生素D3的拖尾因子不得大于2.0。取對照品溶液重復進樣6次，維生素D3峰面積的相對標準偏差應不大于3.0%；另取對照品儲備液Ⅱ適量，在55℃水浴中加熱1小時，放冷，取該溶液40μl注入液相色譜儀，維生素D3前體峰與維生素D3峰之間的分離度應大于3.0。

供試品溶液：取本品20片，精密稱定，研細，精密稱取適量（約相當于維生素D3250IU），置50ml離心管中，加入75%二甲亞砜水溶液約20ml，密塞搖勻，將離心管置于45℃±5℃水浴超聲15分鐘，并不時振搖，放冷。精密加入用75%二甲亞砜水溶液處理過的正己烷（75%二甲亞砜水溶液和正己烷按1∶20進行混勻后，取正己烷層）15ml，振搖90分鐘，3000rpm離心10分鐘，取上清液作為供試品溶液。

對照品溶液：精密稱取維生素D3對照品（40000IU/mg）約25mg，置100ml量瓶中，加上述75%二甲亞砜水溶液處理過的正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液Ⅰ。精密量取對照品儲備液Ⅰ5ml，置100ml量瓶中，加上述75%二甲亞砜水溶液處理過的正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液Ⅱ。再精密量取對照品儲備液Ⅱ5ml，置100ml量瓶中，加上述75%二甲亞砜水溶液處理過的正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

精密量取供試品溶液和對照品溶液各40ml，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。取上述75%二甲亞砜水溶液處理過的正己烷作為空白溶液，同法進樣，以消除對含量測定的干擾。按下式計算維生素D3的總量：維生素D3總量=維生素D3含量+維生素D3前體含量=維生素D3含量×1.09。

2.1.3皂化法 供試品溶液：取本品1片置于圓底燒瓶中，加入20ml的水振搖使溶解，混勻，再加入1.0g抗壞血酸和0.1gBHT，混勻，加入30ml的乙醇和10-20ml的氫氧化鉀溶液（50g KOH/50g水），混勻后于80℃恒溫水浴皂化30min。皂化后冷卻至室溫，用乙醇∶水=1∶1轉移定容至100ml。取適量皂化液，先高速離心10min（＞5000rpm），再用0.22μm的針式濾器過濾（尼龍濾膜，5190-5271）至進樣瓶中，待測。

對照品溶液：精密稱取維生素D3標準品10.0mg，用無水乙醇溶解后，轉移至100ml容量瓶定容，精密量取0.5ml于100ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，再精密量取1ml于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻（VD3：0.05μg/ml）。

2.2維生素D3含量測定

2.2.1反相高效液相色譜法 采用Agilent超高效液相色譜儀，以十八烷基鍵合硅膠為填充劑（色譜柱: Welch Ultimate LPC18，4.6×150mm，5μm，SN：60201201105），以乙腈-甲醇（9∶1）為流動相，流速為1 ml/分鐘，檢測波長為265nm，進樣量為20μl，記錄色譜圖。

2.2.2正相高效液相色譜法 采用Agilent高效液相色譜儀，以硅膠為填充劑（色譜柱: Welch Ultimate SiO2，4.6×250mm，5μm，SN：60210301071），流速為1.0 ml/分鐘，檢測波長為265nm，進樣量為40μl，以含0.45%（V/V）異丙醇的正己烷溶液為流動相A，以含20%（V/V）異丙醇的正己烷溶液為流動相B，按表1進行梯度洗脫，記錄色譜圖。

2.2.3在線固相萃取-二維液相色譜方法 采用Agilent高效液相色譜儀，按下面步驟確定維生素D3分析方法。

第一步：流路連接，見圖1。

第二步：確定維生素D3的切割窗口。根據色譜條件（表2）按順序分別進一針空白溶液，兩針對照品溶液，保證保留時間重復性后，得到維生素D3的保留時間。

表2 維生素D3系統驗證分析方法

第三步：建立完整的維生素D3分析方法。根據結果確定維生素D3捕獲窗口并編輯閥2的切換時間。切換開始時間為維生素D3峰起始時間減去0.1min，切換結束時間為維生素D3峰回到基線時間加0.1min。其余條件與表2條件一樣，得到完整的維生素D3分析方法（見表3所示）。用該方法再進一針對照品溶液，可以在1D檢測器和2D檢測器分布得到維生素D3色譜圖。

表3 維生素D3完整分析方法

3 實驗結果分析

3.1萃取后真空旋蒸至干復溶法-反相高效液相色譜法

3.1.1系統適用性 按2.1.1所述方法，制備熱破壞后的維生素D3對照品溶液，精密吸取溶液按照2.2.1所述色譜條件進樣測定，色譜圖見圖2。結果表明，維生素D3峰（保留時間17.531min）與前維生素D3峰（保留時間16.472min）的分離度符合藥典規定的要求（1.6）。

圖2 系統適用性色譜圖

3.1.2含量測定結果 取供試品共10份，依法測定結果，并計算相對平均偏差。10份樣品的平均含量為108.6%，在藥典規定的范圍內（90.0%-122.5%），相對平均偏差為1.8%。

3.2有機溶劑提取法-正相高效液相色譜法

3.2.1系統適用性 按2.1.2所述方法，制備系統適用性溶液，精密吸取系統適應性溶液，按照2.2.2所述色譜條件進樣測定，色譜圖見圖3。結果表明，維生素D3的拖尾因子不大于2.0（1.3），取對照品溶液重復進樣6次，維生素D3峰面積的相對標準偏差不大于3.0%（0.4%），維生素D3前體峰（保留時間16.733min）與維生素D3峰（保留時間28.004min）之間的分離度大于3.0（17.2）。

圖3 系統適用性色譜圖

3.2.2含量測定結果 取供試品共2份，依法測定結果，并計算相對平均偏差。2份樣品的平均含量為102.3%，在藥典規定的范圍內（90.0%-122.5%），相對平均偏差為0.6%。

3.3皂化法-在線固相萃取-二維液相色譜方法

3.3.1系統適用性 按2.1.3所述方法，制備對照品溶液，精密吸取對照品溶液，按照2.2.3所述色譜條件進樣測定，色譜圖見圖4。結果表明，維生素D3出峰時間為21.899min，且與相鄰峰分離良好。

圖4 系統適用性色譜圖

3.3.2測量線性與范圍 按2.1.3所述方法，制備不同濃度的對照品溶液（0.005μg/ml、0.0125μg/ml、0.025μg/ml、0.05μg/ml、0.125μg/ml、0.25μg/ml），以測得的響應信號（峰面積）對被分析物濃度的函數作圖，用最小二乘法進行線性回歸，結果如圖5所示。結果表明，線性相關系數r2=0.993，線性關系良好。

圖5 維生素D3含量測定線性范圍

3.3.3含量測定結果 取供試品共2份，依法測定結果，并計算相對平均偏差。2份樣品的平均含量為103.5%，在藥典規定的范圍內（90.0%-122.5%），相對平均偏差為1.0%。

4 討論

碳酸鈣D3片中維生素D3含量很低，一直以來其分析過程操作繁瑣，樣品回收重現性差。碳酸鈣D3片是臨床大量使用的一種鈣補充劑，對其準確定量意義顯著。本文采用了三種方法提取分離并測定碳酸鈣D3片中的維生素D3含量，三種方法測定的含量結果分別為108.6%、102.3%、103.5%，均在藥典規定的范圍內，三種提取方法均滿足對碳酸鈣D3片中維生素D3測定的前處理要求，其中真空旋蒸至干復溶法，提取過程復雜，耗時費力，有機溶劑提取法，耗費大量有機試劑，和目前提倡的環境保護理念不相適應。而本文中使用的皂化法前處理步驟最方便快捷，相對于《GB 5009.82-2016食品安全國家標準 食品中維生素 A，D，E的測定》中采用的提取方法，簡化了提取步驟，避免了大量破壞環境有機試劑的使用，配合使用在線固相萃取-二維液相色譜方法測定含量，效率更高、準確度更好，此方法更適用于碳酸鈣D3片中維生素D3含量的測定。

近年來，在線固相萃取-二維液相色譜技術以峰容量大、基質效應低、分析通量高等特點被廣泛應用于食品檢測行業中[3]，但在藥物檢測中的應用相對較少。《中國藥典》2020年版四部（通則0722）對維生素D的前處理須通過皂化、提取、分離、液相收集等步驟，這種前處理方式較為繁瑣，不適合處理大量樣品，而且對實驗人員的操作水平也有較高要求。本文中采用的分析方法將樣品溶液皂化后經簡單定容便可直接進行檢測，進樣后樣品溶液經第一個六通閥，通過在線固相萃取小柱凈化，凈化液進入一維色譜，一維色譜采用C8色譜柱，進行初步分離，根據維生素D3在一維色譜上的出峰時間，確定切換時間，將這一段時間內的流出液經另一個六通閥上的捕獲柱富集，轉入二維色譜進一步分離，實現對維生素D3的快速測定[4-5]。此方法不僅可以用于制劑中維生素D3的檢測，還可以用于復合維生素片中維生素A、維生素D2、維生素D3、維生素E的分離檢測。在線固相萃取-二維液相色譜技術作為一種高效的分離分析手段，與傳統的定量方法相比，該柱切換系統無需繁瑣的制備過程，大大提高了分析效率，該技術在嬰幼兒配方食品、配方乳制品中維生素A、D、E的實際檢測應用方面已經取得了較好的效果，也為復合維生素片中維生素A、D、E的含量測定提供了新思路和新參考。但是，二維液相色譜儀器的價格昂貴且維護成本較高，導致該技術在維生素A、D和E檢測中的應用方面受到了局限，多用于研究性領域，另外對于復雜制劑中維生素A、D、E和其他脂溶性維生素的檢測還有待于更深入的研究和開發。未來，隨著二維液相色譜的不斷發展完善，以及應用面的擴大和經驗的積累和總結，這一技術將具有良好的應用前景。