海參酶酵液對小鼠急性酒精性肝損傷的作用*

孫東映，韋錦斌

（1.廣西醫科大學第三附屬醫院，南寧 530031；2.廣西醫科大學，南寧 530021）

酗酒已成為當今世界備受關注的健康問題，造成了重大的社會和經濟負擔。近年來，我國酗酒人數逐年上升并且逐漸年輕化，導致酒精性肝損傷的發病率不斷升高[1]。酒精性肝損傷的形成是一個較為復雜的過程，初期癥狀以酒精性脂肪肝為主，逐漸進展為酒精性肝炎和酒精性肝硬化，直至肝功能衰竭[2-3]。目前，酒精性肝損傷的發病機制尚未完全闡明。戒酒、藥物治療以及外科肝移植依舊是酒精性肝損傷的主要干預措施[4]。海參是廣泛分布于全世界各大洋中的一類無脊椎海洋生物，同時也是調節海洋生態系統的最重要的物種之一[5]。海參除了含有豐富的蛋白質、礦物質和維生素等營養成分外，還富含多種生物活性物質，如海參多糖、三萜皂苷、海參肽、膠原蛋白、脂類物質等[6-8]。研究表明，海參具有抗氧化、抗炎、提高免疫、抗腫瘤、降脂、抗血栓、保肝、延緩衰老等藥理作用[9]。本研究通過酒精灌胃法建立急性酒精性肝損傷小鼠模型，以保肝藥物水飛薊賓為陽性藥物作為對比，研究海參酶酵液（HSMJY）對急性酒精性肝損傷的作用，為HSMJY 應用于急性酒精性肝損傷的防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60 只SPF 級昆明小鼠，雄性，體重（20±2）g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK（桂）2020-0003，動物使用許可證號：SYXK（桂）2020-0004。本研究所涉及的動物實驗操作均嚴格遵守廣西醫科大學實驗動物中心動物倫理委員會的指導原則。

1.2 藥物 HSMJY由廣西醫科大學基礎醫學院微生物教研室提供，批號：20220104。250 g生海參（大連產刺參，去除內臟），先用蛋白酶酶解，后用益生菌發酵，得到960 mL 的HSMJY，海參含量為26%。水飛薊賓膠囊購自天津天士力圣特制藥有限公司，批號：150711078。

1.3 主要試劑和儀器 丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、蛋白定量（TP）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒均購自上海泛柯實業有限公司；無水乙醇（AR）購自廣東光華科技股份有限公司。

高速冷凍離心機（德國Hettich UNIVERSAL，型號320R臺式）；電熱恒溫干燥箱（上海躍進醫療器械廠，型號GZX-DH 400-S-II）；-80 ℃超低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司，型號DW-86L628）；全波長全自動多功能酶標儀（美國Thermo Fisher，型號Multiskan Go）。

1.4 動物分組、給藥及造模 所有小鼠適應性喂養1 周后，隨機分為正常組、模型組、水飛薊賓組（50 mg/kg）、HSMJY 高劑量（HSMJY-H）組（7.8 g/kg）、HSMJY 中劑量（HSMJY-M）組（5.2 g/kg）、HSMJY低劑量（HSMJY-L）組（2.6 g/kg），每組10 只。實驗第1～9 天：各給藥組小鼠灌胃給予相應劑量藥物，正常組與模型組灌胃給予等體積的蒸餾水，1 次/d，連續9 d。第9～12天：即實驗第9天起，每天上午正常給予相應劑量藥物，1 h 后除正常組外，其余組小鼠灌胃40%乙醇溶液（10 mL/kg），連續4 d。造模參考Song 等[10-11]方法改良，建立小鼠急性酒精性肝損傷模型，同時正常組小鼠灌胃等體積蒸餾水。

1.5 標本制備 末次給予乙醇溶液后，禁食不禁水4 h。摘眼球取血，室溫靜置2 h，3500 r/min 離心10 min，取上層血清分裝于不同EP 管內，保存于-80 ℃冰箱中備用。取血后頸椎脫臼法處死小鼠，解剖取肝臟組織，稱重。用4%多聚甲醛固定部分肝臟組織，留待病理檢測；其余肝組織加入9倍量生理鹽水制備10%肝勻漿液，3 500 r/min離心10 min，取上清液分裝，保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.6 肝臟指數檢測 迅速解剖后取出肝臟，用0.9%生理鹽水洗去血液，濾紙吸凈后稱定肝臟重量，計算小鼠肝臟指數，肝臟指數＝肝臟重量（g）/體重（g）×100%。

1.7 生化指標測定 檢測各組小鼠血清AST、ALT含量，測定肝臟組織SOD 活性及MDA、IL-1β、IL-6和TNF-α含量，具體實驗方法參照試劑盒說明書進行操作。

1.8 肝臟組織病理學觀察 4%多聚甲醛固定24 h后，常規透明、脫水、石蠟包埋，連續切片，行蘇木精—伊紅（HE）染色，于光學顯微鏡下觀察肝組織病理改變。

1.9 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件處理數據，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HSMJY對小鼠肝臟指數及血清肝功能酶學指標的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝臟指數和血清AST、ALT活性升高（P＜0.01）；與模型組比較，HSMJY-H 組、HSMJY-M 組及水飛薊賓組小鼠肝臟指數和AST、ALT活性降低（P＜0.05），見表1。

表1 HSMJY對小鼠肝臟指數及血清AST、ALT水平的影響n=10，

與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.2 HSMJY對小鼠肝組織病理學變化的影響 正常組小鼠肝組織細胞結構完整且肝細胞索排列整齊，細胞核清晰可見，位于細胞中央，肝小葉結構清晰，肝細胞無明顯的脂肪泡、或變性壞死，無炎癥細胞浸潤；模型組小鼠肝細胞形態不規則，肝細胞索排列紊亂，肝細胞內出現大小不等、數量較多的圓形脂肪空泡（脂滴），出現炎癥細胞浸潤現象，肝小葉結構模糊，少部分肝細胞核固縮，表明急性酒精性肝損傷模型復制成功；與模型組比較，水飛薊賓組及HSMJY各劑量組的小鼠肝臟組織的病理損傷均有改善，并且以高劑量的作用效果較好，見圖1。

2.3 HSMJY對小鼠肝臟氧化應激指標的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝臟抗氧化酶SOD活性降低，MDA 含量顯著升高（均P＜0.01）；與模型組比較，HSMJY 及水飛薊賓可顯著提高SOD 活力，降低MDA含量（P＜0.01），見表2。

表2 HSMJY對小鼠SOD活性和MDA含量的影響n=10，

表2 HSMJY對小鼠SOD活性和MDA含量的影響n=10，

與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

2.4 HSMJY對小鼠肝臟炎癥指標的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝臟炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，HSMJY 中、高劑量及水飛薊賓均可降低炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量（P＜0.05），見表3。

表3 HSMJY對小鼠IL-1β、IL-6和TNF-α含量的影響n=10，

表3 HSMJY對小鼠IL-1β、IL-6和TNF-α含量的影響n=10，

與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

3 討論

本研究通過直接酒精灌胃方法構建小鼠急性酒精性肝損傷模型，該方法具有周期短、容易復制、穩定性好、死亡率低等優點，與人類在短時間內大量飲酒所致的肝臟損傷特點相似；并且以肝臟及血液中一些化學指標的變化為主要特征，為進一步研究急性酒精性肝損傷的發病機制以及后續保肝藥物研究與開發提供了一種可行方法。

肝臟指數可反映肝臟腫大的程度，而肝臟腫大則被認為是酒精性肝損傷的一種常見臨床表現[12]。AST、ALT是肝功能評估中敏感的生化指標[13]，主要分布于肝細胞質中，臨床上利用這兩個指標水平來代表肝損傷的嚴重程度，一般情況下，當肝臟受到某些有害因素的影響，肝細胞被破壞，肝臟受損，導致大量AST和ALT被釋放入血，促使血液中AST和ALT 水平顯著提高[14]。本研究結果顯示，模型組小鼠較正常組肝臟指數及血清AST、ALT 水平顯著升高，表明肝細胞受到損傷，急性酒精性肝損傷模型成功建立。HSMJY 各劑量組對急性酒精性肝損傷小鼠的肝臟腫脹有一定抑制作用，能改善肝臟病變，使血清AST、ALT活性恢復正常，進而達到保護肝臟的作用。同時，本研究發現模型組中小鼠肝臟發生損傷，其肝臟組織病理學變化主要表現為肝細胞形態不規則，肝細胞索排列紊亂，出現較多的脂滴（脂肪堆積的明顯特征），出現了炎癥細胞浸潤現象，肝小葉結構模糊，少部分肝細胞核固縮。不同劑量HSMJY 干預可以改善這些異常改變，減少肝臟損傷。

氧化應激在急性酒精性肝損傷病程的發展過程中發揮重要作用。酒精在代謝過程中會產生大量的活性氧（ROS），造成機體的氧化及抗氧化防御功能失衡，進而引起氧化應激，是急性酒精性肝損傷產生和發展的一個重要機制[15]。SOD和MDA均會受到氧化應激條件的影響。SOD 活性的降低將引起氧自由基的累積，進而誘發細胞損傷，間接對機體清除氧自由基的能力產生影響。MDA 作為脂質過氧化的最終產物，不僅可以反映人體內的脂質過氧化水平，還能間接地反映人體肝細胞的損傷程度[16]。本研究結果顯示，模型組小鼠肝臟中SOD活性顯著降低，同時MDA的含量明顯升高，表明在模型組小鼠體內發生了較為嚴重的氧化應激反應。然而，HSMJY 干預處理可顯著提高小鼠肝臟中SOD 活性，減少肝臟中MDA 的含量。這一結果表明，HSMJY 可增強肝細胞的抗氧化能力，具有良好的抗氧化應激能力，進而減少酒精所誘導的急性肝臟損傷，這可能與其所含的抗氧化成分有關。

在酒精性肝損傷情況下，不僅氧化應激系統發生異常，還常常伴有炎癥反應的發生。炎癥反應對肝臟造成損傷，炎癥細胞激活后分泌的大量炎癥因子對酒精所誘導的急性肝損傷進程起到十分重要的作用。炎癥反應會導致肝臟實質性損傷，進而發展為肝纖維化甚至肝功能衰竭[17]。在機體受到酒精的刺激后，會誘發促炎細胞因子的釋放，包括TNFα、IL-1β和IL-6等[18]，而這些促炎細胞因子可引發脂肪變性，造成肝細胞炎性損傷及凋亡，加速急性酒精性肝損傷的發展。本研究結果顯示，正常組小鼠肝組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量較低，急性酒精性肝損傷可顯著增加這些炎癥因子，提示IL-1β、IL-6和TNF-α可能參與了急性酒精性肝損傷的發生和發展。而HSMJY 能顯著降低IL-1β、IL-6 和TNF-α的水平，表明HSMJY 還可能通過抗炎作用從而發揮抗急性酒精性肝損傷作用。

海洋生物因獨特而豐富的生理和藥理活性而受到關注，用于開發新型食品及藥物具有巨大潛力。本研究所采用的HSMJY 與傳統海參食品比較，酶解發酵可將海參大分子蛋白分解為易吸收的小分組蛋白質、寡肽、小肽和游離氨基酸等，所得產物具有活性成分豐富，營養價值高，穩定性和溶解性良好，易于消化和吸收，食用安全等特點。HSMJY中不僅含有海參多肽，而且還含有其他一些活性強的化合物，如多糖、皂苷及腦苷脂等。近年來，關于海參提取物各種生物活性已在多種干預處理模型中均有過報道。本研究主要評價了HSMJY在小鼠體內抗急性酒精性肝損傷活性，并未明確分析其具體起作用的活性組分，因此后續將做進一步研究。

綜上所述，HSMJY對小鼠急性酒精性肝損傷具有一定的保護作用，其機制可能與抑制氧化應激和炎癥反應有關。