基于TLR4/NF-κB 信號通路探討防風(fēng)治療潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的機制研究

朱 聰 張貴陽 陳 燕 余 勝 鄭照正

湖州市中心醫(yī)院肛腸外科，浙江湖州 313000

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以腹痛、腹瀉、黏液膿血便為主要臨床特征的特發(fā)性腸道炎性疾病，可引起結(jié)直腸黏膜及黏膜下層炎癥和形態(tài)學(xué)改變。UC 的發(fā)病機制目前仍不完全清晰，但免疫功能障礙、個體遺傳多樣性、腸道菌群紊亂等因素被證實與UC 發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。近年來，隨著研究的不斷深入，Toll 樣受體4/核因子κB（Toll–like receptors 4/nuclear factor kappa–B，TLR4/NF–κB）信號通路在UC 發(fā)生、發(fā)展中的重要作用逐漸明確。TLR4/NF–κB 信號通路是與機體抗炎、免疫等機制密切相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中TLR4 是Toll 樣受體家族中的重要一員，是免疫細(xì)胞表面識別病原體相關(guān)分子的識別受體，其激活后一方面可直接導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子和趨化因子的分泌，另一方面可導(dǎo)致NF–κB 的核移位；NF–κB 在真核細(xì)胞中表達(dá)廣泛，主要參與細(xì)胞內(nèi)信息傳遞和相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，并在炎癥相關(guān)的連鎖反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

防風(fēng)又名“屏風(fēng)”，最初記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，在治療“痛瀉”方中常作為佐使藥，但這并不影響防風(fēng)的重要性，其劑量對治療效果起著至關(guān)重要的作用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為，防風(fēng)具有消炎、鎮(zhèn)痛等功效，且臨床研究表明，防風(fēng)在臨床治療UC 中能有效減輕患者的疼痛、修復(fù)腸黏膜等。基礎(chǔ)實驗結(jié)果也顯示，防風(fēng)能有效降低UC 大鼠炎癥因子的表達(dá)。防風(fēng)對UC 的治療效果十分顯著，但關(guān)于其作用機制的研究報道較少。因此，本文就防風(fēng)治療UC 的作用機制進(jìn)行初步探討，以求證防風(fēng)是否通過TLR4/NF–κB信號通路減輕炎癥治療大鼠的潰瘍性結(jié)腸炎，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 本實驗所用SPF級雄性SD大鼠均購置于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017–0005]，平均體重（200±10）g，所有大鼠均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)[使用許可證號：SYXK（浙）2018–001]，飼養(yǎng)期間保持大鼠能自由進(jìn)食及飲水，保持環(huán)境溫度（23±2）℃，濕度60%，12h 循環(huán)燈光。本研究有關(guān)動物實驗操作均在浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心進(jìn)行，且實驗所涉及的所有操作均符合《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》，并獲浙江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審批通過（倫理審批號：IACUC–20200506–12）。

1.1.2 試劑與儀器 2，4，6–三硝基苯磺酸（2,4,6–trinitrobenzenesulfonic acid sol，TNBS，杭州高晟生物科技有限公司，規(guī)格：1ml，批號：MB5547），TLR4 抗體（杭州悅耳科技有限公司，規(guī)格：100μl，批號：yrTLR4），NF–κB 抗體（上海泰坦科技股份有限公司，規(guī)格：50μg，貨號：04212009），蘇木精–伊紅染色試劑盒（杭州高晟生物科技有限公司，規(guī)格：3×500ml，貨號：RS3390），生理鹽水（杭州馨然生物科技有限公司，規(guī)格：500ml，批號7732–18–5），白細(xì)胞介素–6（Interleukin–6，IL–6），白細(xì)胞介素–8（Interleukin–8，IL–8），腫瘤壞死因子–α（tumor necrosis factor–α，TNF–α）ELISA 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，規(guī)格：96 次，批號：依次為SEKR–0005、SEKR–0071、SEKR–0009）。冷凍高速離心機（賽默飛世爾科技公司，F(xiàn)resco 21）；多功能酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司，SuPerMax 3000AL）；Odyssey 雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國Li–Cor，Odyssey Clx）；電泳、電轉(zhuǎn)系統(tǒng)[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，MP–8001]。

1.1.3 藥物 防風(fēng)50g 購置于浙江中醫(yī)藥大學(xué)名中醫(yī)館中藥房。所購防風(fēng)放于10 倍質(zhì)量的超純水中浸泡1h，然后將浸泡液與藥材一起煮沸1h 后過濾水煎液，再次加入10 倍質(zhì)量的超純水后煮沸1h，合并2次水煎液，濃縮至水煎液濃度為0.5g/ml，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 造模及干預(yù) 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，采用隨機數(shù)字表法將其分為正常組、模型組、治療組，每組各8 只；使用5%的TNBS 結(jié)腸內(nèi)灌注建立UC 大鼠模型。大鼠腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉（0.15ml/100g）進(jìn)行麻醉后，將橡膠輸液管插入大鼠肛門上段8cm 處，注入5%TNBS（100mg/kg，溶于50%乙醇，總體積1ml），為防止結(jié)腸內(nèi)滴注后液體滲漏，并確保誘發(fā)UC，注入后提起大鼠尾巴，保持倒置1min。正常組大鼠給予等量生理鹽水結(jié)腸灌注。造模72h 后，治療組大鼠予防風(fēng)水提液灌胃治療，灌胃劑量為0.9g/kg，此劑量依據(jù)《實驗動物和動物實驗技術(shù)》動物給藥量計算，并根據(jù)大鼠與人的體表面積等效劑量比值進(jìn)行折算，正常組及模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)14d。

1.2.2 DAI 評分記錄 根據(jù)表1 所示的DAI 評分標(biāo)準(zhǔn)，評估各組大鼠造模后治療前、治療后的各項指標(biāo)并記錄。

表1 DAI 評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3 樣本收集及大體觀察 治療14d 后，CO麻醉大鼠并進(jìn)行心臟取血，隨后處死大鼠收集完整結(jié)腸組織，肉眼觀察結(jié)腸形態(tài)、顏色等改變，測量記錄結(jié)腸長度，結(jié)束后4%多聚甲醛組織固定液或–80℃保存組織，收集的血液靜置30min 后，離心機3000轉(zhuǎn)/min 離心15min（離心半徑99mm）分離取上清，標(biāo)記后–20℃冰箱保存，待后續(xù)檢測。

1.2.4 蘇木精–伊紅染色及病理評分 經(jīng)4%多聚甲醛組織固定液固定的結(jié)腸組織，取病變最明顯處，常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木精–伊紅染色后置光鏡下對其組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行詳細(xì)地觀察，并參照表2 進(jìn)行病理學(xué)評分。

表2 病理評分表

1.2.5 各組大鼠血清中炎癥因子檢測 炎癥因子指標(biāo)包括IL–6、IL–8、TNF–α。取凍存的血清樣本，自然解凍后按照ELISA 試劑盒說明書操作，最后加入終止液50μl/孔，搖晃均勻后使用酶標(biāo)儀在450nm處讀取各孔吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算各樣品相應(yīng)濃度并記錄。

1.2.6 Western blotting 檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 凍存的結(jié)腸組織自然解凍稱重后使用組織破碎儀研磨成勻漿，在勻漿中加入放射免疫沉淀試驗（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液中含有1%苯甲基磺酰氟（phenyl methyl sulfonyl fluoride，PMSF），組織與RIPA–裂解液的比例為10mg:100μl，并放置在冰上裂解2h，充分裂解后12000r/min 離心15min（離心半徑99mm），取上清液用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒檢測蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液95℃變性10min，變性后的樣本置于–20℃長期保存。使用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS–PAGE）分離蛋白，各孔加入蛋白樣本及Marker 后設(shè)置電泳電壓為120V，待所需蛋白分子量范圍分離后將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，然后用5%三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水與聚山梨醇酯–20（tris buffered saline with tween–20，TBST）配置的脫脂奶粉室溫封閉1h，TBST洗膜3 次后裁剪出所有的條帶并分別加入抗TLR4抗體、抗NF–κB 抗體（1:1000），4℃孵育過夜；隔日回收一抗，并用TBST 洗膜3×5min；加入對應(yīng)種屬的二抗，室溫孵育1h，TBST 洗膜3 次，去離子水洗膜1次后，用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃膜，所得圖像用系統(tǒng)自帶軟件計算灰度值面積。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 DAI 評分

實驗中各組大鼠均無死亡。造模前，各組大鼠DAI 評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）。造模后，模型組及治療組大鼠均開始出現(xiàn)不同程度的精神萎靡、弓背現(xiàn)象、毛色發(fā)黃、腹瀉、黏液膿血便；治療后，大鼠活動狀態(tài)、血便及腹瀉情況均有改善。模型組及治療組大鼠治療前DAI 評分均高于造模前，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；治療組大鼠治療后DAI 評分低于治療前，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。各組大鼠DAI 評分見圖1。

圖1 各組大鼠DAI 評分

2.2 結(jié)腸改變情況

模型組大鼠結(jié)腸出現(xiàn)不同程度的水腫并導(dǎo)致結(jié)腸部分膨出，甚至糜爛、潰瘍出血，治療組大鼠結(jié)腸水腫有所改善，無潰瘍破裂出血。從結(jié)腸長度分析，模型組大鼠的結(jié)腸長度（15.22±1.91）cm 較正常組（18.23±2.14）cm 顯著縮短，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；治療組大鼠結(jié)腸長度（17.33±2.21）cm與模型組相比顯著增長，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01），見圖2。

圖2 各組大鼠結(jié)腸大體觀及長度測量

2.3 各組大鼠結(jié)腸組織病理改變及評分

正常組大鼠結(jié)腸組織病理切片經(jīng)蘇木精–伊紅染色后在光鏡下可見結(jié)構(gòu)完整，腺體排列整齊，隱窩結(jié)構(gòu)規(guī)則，糜爛、炎癥細(xì)胞浸潤不可見；模型組大鼠結(jié)腸組織可見大量的腺體缺失并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤，黏膜下層亦可見大量炎癥細(xì)胞浸潤及細(xì)胞水腫，潰瘍灶形成；治療組大鼠上述情況有所改善，腺體排列尚整齊，少量缺失，伴有少量炎癥細(xì)胞浸潤，見圖3。各組大鼠結(jié)腸組織病理評分如表2所示，與正常組[（1.81±0.43）分]比較，模型組大鼠病理評分[（5.92±0.68）分]顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；而治療組病理評分[（3.09±0.51）分]較模型組[（5.92±0.68）分]顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織蘇木精–伊紅染色（×20）

2.4 各組大鼠血清炎癥因子檢測結(jié)果

各組大鼠血清中炎癥因子檢測結(jié)果見圖4，模型組大鼠的炎癥因子IL–6、IL–8、TNF–α 水平均顯著高于正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；經(jīng)防風(fēng)治療后，治療組大鼠的炎癥因子相較于模型組均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。

圖4 各組大鼠血清炎癥因子檢測結(jié)果

2.5 Western bloting 檢測結(jié)果

各組大鼠結(jié)腸組織TLR4、NF–κB 蛋白表達(dá)情況見圖5，計算灰度值并統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的TLR4、NF–κB 蛋白表達(dá)較正常組顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；經(jīng)防風(fēng)治療后，治療組大鼠的TLR4、NF–κB 蛋白表達(dá)較模型組明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01），見圖6。

圖5 Western bloting 檢測大鼠結(jié)腸組織TLR4、NF–κB 蛋白表達(dá)

圖6 大鼠結(jié)腸組織TLR4、NF–κB 蛋白相對表達(dá)量

3 討論

隨著對UC 發(fā)病機制的深入研究，更多新型的治療方式及藥物應(yīng)用于臨床治療UC，包括免疫抑制治療、微生態(tài)治療、激素類藥物的應(yīng)用等。祖國醫(yī)學(xué)博大精深，對UC 的發(fā)病機制及治療有獨到的見解。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為UC 癥主痛、瀉，遷延不愈，述如“春傷于風(fēng)，夏生后泄腸澼”，當(dāng)屬“腸癖”“痢疾”“泄瀉”等范疇。發(fā)病機制如脾失健運、氣機不暢致運化不及，產(chǎn)生食積、水飲、痰濁、瘀血等病理產(chǎn)物，則水谷停滯，最終導(dǎo)致胃腸功能紊亂、便血等臨床表現(xiàn)。防風(fēng)屬風(fēng)藥，味辛甘，性微溫；可補脾土而瀉肝木，祛風(fēng)調(diào)氣機以止痛瀉，發(fā)揮舒脾止瀉之功。臨床使用防風(fēng)治療UC 效果十分顯著，可有效緩解患者的腹痛、腹瀉等癥狀。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，防風(fēng)具有調(diào)節(jié)機體免疫、抑制組織炎癥等功效，但其治療UC 的具體機制尚無明確報道。本研究通過應(yīng)用防風(fēng)治療TNBS 誘導(dǎo)的UC 模型大鼠，嘗試探討防風(fēng)治療UC 的潛在機制。本研究中，防風(fēng)可有效緩解UC 大鼠的癥狀，減輕炎性反應(yīng)，同時降低TLR4、NF–κB 蛋白的表達(dá)。

TLR4/NF–κB 信號通路參與的炎性反應(yīng)影響UC發(fā)生、發(fā)展的各個環(huán)節(jié)。TLR4 是與免疫及炎癥相關(guān)的主要受體，其可通過多條途徑激活，在經(jīng)典途徑中，通過識別髓系分化因子–88（MyD88）等配體激活轉(zhuǎn)錄因子NF–κB；激活后或過度活化的NF–κB 則會大量釋放TNF–α、IL–6、IL–8、趨化因子（C–C 基元）配體2（chemokine（C–C motif ligand 2，CCL2）、環(huán)氧合酶–2（cyclooxygenase–2，COX–2）及前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）等炎癥因子。本研究選擇其中的TNF–α、IL–6、IL–8 作為炎癥因子檢測指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)其隨TLR4、NF–κB 蛋白表達(dá)的下降而下降，治療組大鼠炎癥因子TNF–α、IL–6、IL–8水平及TLR4、NF–κB 的表達(dá)與模型組大鼠相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。

綜上所述，防風(fēng)可通過TLR4/NF–κB 信號通路減輕炎性反應(yīng)，從而治療UC 大鼠。