丹紅注射液對老齡大鼠麻醉術后早期認知功能障礙的影響

趙鈞慧 孔雯雯 孫美艷 趙曉勇 周垂賢

1.濰坊醫學院麻醉學院，山東濰坊 261053；2.濰坊市中醫院麻醉科，山東濰坊 261000；3.濰坊市中醫院神經外科，山東濰坊 261000

麻醉手術后患者會出現甚至是持久存在的記憶力、定向力等方面的障礙及社會活動能力的減退，稱作術后認知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD），其主要表現為人格或社交能力及技巧等方面的改變，而不是智商的改變。輕度POCD 患者僅在認知功能上表現出與正常人的差異，且持續時間短，可自愈，僅給生活、工作帶來些許不便；重度POCD 患者則表現出嚴重記憶損害，包括語言概括或判斷能力的喪失及人格改變，可持續3個月以上甚至長期存在，從而導致患者的社會活動及生活自理能力減退甚至喪失，給個人、家庭和社會帶來負擔，因此尋找有效干預術后認知障礙的方法是目前研究的熱點。

POCD 的產生與多種因素有關，其中年齡較大者較其他人更易發生。研究發現，年齡＞60 歲的患者經歷非心臟大手術，術后1 周及3 個月的POCD發生率分別為26%和10%。由此可見，尋找干預老年患者麻醉術后早期POCD 的藥物具有重要意義。近年來，中藥注射劑在我國的應用越來越廣泛，以黃酮類和酚類化合物為主要成分的丹紅注射液（danhong injection，DHI）作為我國傳統的中藥材，主要從丹參、紅花中提煉獲取，已有研究表明其在抑制血栓、清除血瘀、減輕氧化損傷等方面具有重要價值。本研究通過建立大鼠POCD 模型，探討DHI 對術后認知功能障礙的影響，為臨床麻醉中應用藥物改善術后早期認知功能障礙提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取健康老年雄性SD 大鼠30 只，無特定病原體（specific–pathogen free，SPF）級別，體重250～300g，均由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，動物許可證號：SCXK（魯）20 190003；動物合格證號：3707262101083423.0。飼養于濰坊醫學院實驗動物中心SPF 級動物飼養房。

1.2 動物分組及POCD 模型建立

采用隨機區組法將大鼠隨機分為對照組、POCD組和實驗組，每組各10 只。POCD 組和實驗組建立POCD 模型。簡單來說，大鼠腹腔麻醉后，依次對腸道、脾、肝、腎等臟器進行探查，完成腹腔探查術。實驗組大鼠于手術結束前30min 及術后第1、2天分別予2ml/kg DHI，POCD 組大鼠在相同時間點給予與實驗組相同劑量的生理鹽水；對照組不進行手術，但在相同時間點給予相同劑量的生理鹽水。

1.3 大鼠的認知功能評價

通過Morris 水迷宮的定位航行試驗和空間探索試驗檢測各組大鼠的空間學習記憶能力，以評估各組大鼠的認知功能，在成功建模1d 后對大鼠進行行為學測試。水池被均勻分成4 個象限，在第4 象限內放一平臺，平臺距離池壁20cm 且平臺頂低于水面2cm。迷宮外參照物在訓練期間始終保持不變。

1.3.1 定位航行實驗 連續5d 記錄大鼠找到平臺的時間作為大鼠的逃逸潛伏期，若大鼠在120s 內仍未找到平臺，則潛伏期記為120s。

1.3.2 空間探索實驗 訓練結束后次日進行空間探索實驗，去除平臺后記錄大鼠120s 內穿過原平臺位置的次數記作大鼠的空間記憶成績。

1.4 分子生化指標檢測

分別于術前及術后6、24、48h 取大鼠靜脈血，放入含有促凝劑的生化試管中，用離心機3000 轉/min離心20min，分離血清，–70℃保存。血清S–100β蛋白、神經元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、腫瘤壞死因子–α（tumor necrosis factor–α，TNF–α）、白細胞介素–6（interleukin–6，IL–6）和白細胞介素–1β（interleukin–1β，IL–1β）水平采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme–linked immunoadsordent assay，ELISA）進行測定。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 Morris 水迷宮實驗評價各組大鼠認知功能

POCD 組大鼠逃逸潛伏期較對照組顯著延長，且穿越平臺次數減少，差異均有統計學意義（＜0.05）；與POCD 組比較，實驗組大鼠逃逸潛伏期縮短，穿越平臺次數增加，差異均有統計學意義（＜0.05）；與對照組比較，實驗組大鼠的逃逸潛伏期延長，穿越平臺次數減少，差異均有統計學意義（＜0.01），表明DHI 能夠提高大鼠的學習記憶能力，在一定程度上改善大鼠的認知功能障礙，但無法完全治愈大鼠的術后認知功能障礙，見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數比較（）

2.2 各組大鼠不同時間點血清中S–100β 蛋白、NSE水平比較

各組大鼠術前血清中S–100β 蛋白、NSE 水平比較，差異無統計學意義（＞0.05）。與對照組比較，POCD 組大鼠術后不同時間點血清中S–100β 蛋白、NSE 水平均增加，差異均有統計學意義（＜0.05）；與 POCD 組比較，實驗組大鼠術后不同時間點S–100β 蛋白、NSE 水平均降低，差異均有統計學意義（＜0.05）；但與對照組比較，實驗組大鼠術后不同時間點S–100β 蛋白、NSE 水平均增加，差異均有統計學意義（＜0.01），表明DHI 能減輕大鼠麻醉術后神經功能的損傷，但不能完全逆轉POCD 造成的損傷，見表2。

表2 各組大鼠不同時間點血清中S–100β 蛋白、NSE 水平比較（，μg/L）

2.3 各組血清中TNF–α、IL–6、IL–1β 水平比較

與對照組比較，POCD 組大鼠術后24h 血清中TNF–α、IL–6、IL–1β 水平均增加，差異均有統計學意義（＜0.05）；與POCD 組比較，實驗組大鼠術后24h 血清中TNF–α、IL–6、IL–1β 水平均降低，差異均有統計學意義（＜0.05）；但實驗組大鼠的炎癥因子水平較對照組有所增加，差異有統計學意義（＜0.01），見表3。

表3 術后24h 各組大鼠血清中TNF–α、IL–1β、IL–6水平比較（，pg/ml）

3 討論

老年人術后常見的神經并發癥之一就是POCD，目前認為POCD 可能是由于患者大腦在手術和麻醉的刺激下發生損傷所致。目前檢測POCD 的分子生物學指標主要有S–100β 蛋白、NSE、ox–LDL、同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）、TNF–α、IL–6、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和血液流變學指標（血漿黏度、全血黏度、血漿纖維蛋白原水平）等，因此，這些標志性分子被研究人員與POCD 聯系起來，旨在探討其中潛在的關系，其中S–100β蛋白和NSE水平可反映神經系統的損傷程度。Hcy是一種含硫基氨基酸，ox–LDL是由血漿LDL經化學氧化修飾等方式氧化而成，其水平的增高可引起內皮細胞的損傷及凋亡。有研究發現，降低血漿中Hcy、ox–LDL 水平可改善患者的認知功能。許多研究表明，分子生物學指標能從不同的機制方面反映或提示腦功能狀態的變化，是研究認知功能常用的相對較成熟的重要指標。因此本研究選用S–100β 蛋白、NSE、TNF–α、IL–6 及IL–1β 作為檢測指標，以探討DHI 是否可改善POCD 大鼠的神經功能損傷情況及能否減輕POCD 帶來的炎性反應，旨在觀察DHI 對改善大鼠術后認知功能障礙產生的影響。

3.1 POCD 相關分子生物學指標的作用及在POCD發生后的改變

S–100β 蛋白是神經元與神經膠質細胞相互關聯的橋梁，主要存在于中樞神經膠質細胞、星型細胞、小膠質細胞及大膠質細胞，被認為是神經系統的特異性蛋白。作為一種神經營養因子，它的適量表達對腦組織的營養保護起到重要作用。研究發現，與年齡相近、性別相同且S–100β 蛋白表達水平正常的患者比較，輕度腦損傷患者血清中的S–100β 蛋白水平顯著升高，同時還發現S–100β 蛋白水平的高表達與認知功能紊亂呈現出一定的相關性，因此該蛋白的表達水平對改善輕微腦損傷患者的預后有重要意義。另外，由于血清中的S–100β 蛋白不受年齡、溫度、某些藥物等因素影響，故其是判斷神經損傷的一個較靈敏的指標。由此可見，在神經科學的研究中可通過檢測S–100β 蛋白水平的高低判斷腦組織或中樞損傷程度。NSE 在神經系統里含量較高，腦組織損傷患者由于血腦屏障被破壞及缺氧、細胞腫脹等因素的共同作用，增加了血腦屏障的通透性，使NSE 進入血液循環，隨后被運送至外周血和腦脊液中，最終導致外周血中NSE 水平升高。因此NSE的表達水平可反映中樞神經系統破壞的程度，NSE水平越高則說明神經系統的損傷越嚴重，且可導致患者認知功能出現紊亂。本研究結果顯示，與對照組比較，POCD 組大鼠的血清中S–100β 蛋白及NSE 水平升高，大鼠的認知功能出現障礙，給予DHI后其水平降低，減輕神經系統的損傷。炎性反應及氧化應激是POCD 常見嚴重并發癥。TNF–α 是炎性反應中最早升高和最重要的細胞因子之一，是反映組織損傷嚴重程度的敏感指標。IL–6 可引起急性炎性反應，是反映腦組織早期損傷程度的重要指標。本研究結果表明，DHI 可降低TNF–α、IL–6 及IL–1β水平，減輕炎性反應對細胞和組織帶來的損傷，對大鼠腦組織具有保護作用。

3.2 POCD 大鼠學習記憶能力及認知功能的評價

研究動物大腦學習記憶機制的常用實驗方法是Morris 水迷宮實驗，其在評價空間學習記憶功能、老年癡呆及海馬功能研究中的重要作用被廣泛認同。其中通過定位航行實驗測得的逃避潛伏期用于評估大鼠的空間學習記憶能力；通過在空間探索實驗中得到的穿越平臺次數評價大鼠獲取空間信息的記憶保持能力。本研究通過建立大鼠POCD 模型來模擬老年患者POCD，進而探討DHI 能否改善POCD大鼠的認知功能，結果顯示，給予DHI 后大鼠的逃逸潛伏期縮短，穿越平臺次數增加，由此得出，DHI 可改善POCD 大鼠的學習記憶能力和術后認知功能。

綜上所述，老年患者麻醉POCD 的發生可影響患者的預后，嚴重者導致患者社會活動、工作及生活自理能力的減退甚至喪失，給個人、家庭和社會帶來負擔。本研究發現，DHI 能降低S–100β 蛋白、NSE、TNF–α、IL–6 及IL–1β 水平，具有保護腦細胞的作用，在一定程度上能夠改善POCD 大鼠的學習記憶能力和術后認知功能，為臨床麻醉中應用中草藥改善麻醉術后老年患者認知功能障礙提供理論依據，對術后認知障礙的防治及改善患者的生活質量具有重要意義。