SFRP1及Dickkopf相關(guān)蛋白1在慢性牙周炎患者牙齦組織中的表達(dá)及意義

陳欣，尼加提·吐?tīng)栠d，熱依拉·庫(kù)爾班

(新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科，新疆 830001)

近年來(lái)，隨著人們生活品質(zhì)的不斷提高，對(duì)口腔衛(wèi)生問(wèn)題重視程度逐漸加強(qiáng)，與之相關(guān)的慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)也逐漸成為了研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)話題。CP是由菌斑、細(xì)菌引起牙周組織的一種慢性炎癥性疾病[1]，常發(fā)生在牙周膜、牙齦、牙槽骨、牙骨質(zhì)，其中牙槽骨的吸收是其較嚴(yán)重的病變，最終可導(dǎo)致牙齒的松動(dòng)及脫落，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[2]。有研究[3]表明，Wnt信號(hào)通路在成骨細(xì)胞的定向、分化、發(fā)育、增殖等生理過(guò)程中具有關(guān)鍵作用，是骨代謝調(diào)控的重要途徑，也是一種檢測(cè)骨喪失的生物標(biāo)志物。Wnt信號(hào)因子在牙周組織中的表達(dá)異常與慢性牙周炎的進(jìn)展程度相關(guān)[4]。分泌型卷曲相關(guān)蛋白(secreted frizzled-related protein 1，SFRP1)是Wnt信號(hào)通路的重要拮抗劑，可競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Wnt蛋白從而抑制Wnt通路激活[5]，能夠減少炎癥細(xì)胞及破骨細(xì)胞數(shù)量，降低牙周支持骨組織的破壞。另一組分泌型糖蛋白(Dickkopf1，DKK1)作為Wnt信號(hào)通路有力的抑制劑，抑制了牙周膜成纖維細(xì)胞中由Wnt介導(dǎo)的成骨活動(dòng)，對(duì)分化起到抑制作用，同時(shí)促進(jìn)骨的破壞[6-7]。本研究通過(guò)檢測(cè)SFRP1和DKK1在CP患者和正常者牙齦組織中的表達(dá)水平情況，研究Wnt信號(hào)通路經(jīng)典拮抗分子SFRP1和DKK1與CP的相關(guān)性，探討SFRP1和DKK1兩種蛋白在成人慢性牙周炎中發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中的作用關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2020年1月至2020年12月就診于新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心的患者，其中被診斷為中、重度CP患者30例(男性18例、女性12例)為實(shí)驗(yàn)組，年齡35～60歲，平均(46.37±5.31)歲；病程1～6年，平均(2.62±0.70)年。牙周健康者15名(男性8名，女性7名)為對(duì)照組，年齡33～61歲，平均(46.58±5.22)歲。兩組性別占比和年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：全身健康狀況良好，無(wú)系統(tǒng)性疾病；無(wú)吸煙史或長(zhǎng)期酗酒史；近3個(gè)月未服用抗生素、非甾體類(lèi)抗炎藥物及其他免疫抑制劑等藥物；無(wú)累及牙齦的黏膜疾病；診斷為慢性牙周炎患者，全口余留牙≥18顆，且近半年內(nèi)未接受過(guò)牙周系統(tǒng)治療者；女性未處于妊娠或哺乳期；無(wú)正畸治療史。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)研究批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：L2021013)，患者及家屬均簽署研究知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑及儀器

重組Anti-SFRP1抗體、重組Anti-DKK1抗體(Abcam公司，美國(guó))，免疫組織化學(xué)染色試劑盒、DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)，山羊抗兔、鼠IgG H&L (HRP)(Abcam公司，美國(guó))，顯微鏡(Nikon生物顯微鏡)，化學(xué)發(fā)光成像儀系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集

選取實(shí)驗(yàn)組患者牙周手術(shù)中切取的口腔內(nèi)牙周炎病灶部位的牙齦組織(排除根尖周組織疾病)；對(duì)照組取自拔除智齒或正畸牙過(guò)程中切取的健康牙齦組織。組織標(biāo)本離體后沖洗干凈，濾紙吸干。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 牙齦組織的蘇木精-伊紅染色(HE染色) 將標(biāo)本用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，將包埋好的組織蠟片切片，常規(guī)進(jìn)行HE染色，用ChemiScope mini化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)、拍照，觀察CP組牙齦組織的病理學(xué)改變，以及正常組的牙齦形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)，明確慢性牙周炎診斷。

1.4.2 牙齦組織的免疫組化檢測(cè)(SP法) 將包埋好的牙齦組織蠟塊連續(xù)切片，切片厚度4 μm，脫蠟復(fù)水，浸入乙二胺四乙酸抗原修復(fù)，放入濕盒中滴加過(guò)氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，分別加入SFEP1及DKK1工作液孵育。配置DAB顯影液避光反應(yīng)，復(fù)染，脫水封片，通過(guò)顯微鏡觀察組織陽(yáng)性染色程度。用蘇木素復(fù)染胞核，鏡下觀察。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，以明確表達(dá)SFRP1及DKK1的卵巢組織作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4.3 免疫組化結(jié)果判定 SFRP1、DKK1在牙齦組織中的表達(dá)使用著色強(qiáng)度積分進(jìn)行雙評(píng)分法判定[8]，在光鏡下每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野(400×)，觀察陽(yáng)性染色的細(xì)胞百分比及著色程度。以有棕黃色顆粒狀沉淀為陽(yáng)性細(xì)胞，著色范圍以陽(yáng)性染色百分比<1%為0分，2%～20%為1分，21%～50%為2分，≥50為3分；著色程度依據(jù)深淺記分，陰性著色為0分，淺黃色為1分，淺褐色為2分，深褐色為3分。上述兩者相加作為著色強(qiáng)度的積分值。

1.4.4 牙齦組織蛋白印跡法(WB)檢測(cè) 將收集到的實(shí)驗(yàn)組和健康組的牙齦組織，置于EP管中，放入液氮內(nèi)速凍，再轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存。樣本稱(chēng)重研磨之后，加入10倍RIPA裂解液離心15 min，收集上清液檢測(cè)蛋白濃度，剩余加入5倍緩沖液加熱使蛋白變性，和配制的BCA工作液加入孔板中，酶標(biāo)儀562 nm處檢測(cè)其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的蛋白濃度，將蛋白樣品濃度與標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線對(duì)應(yīng)計(jì)算。蛋白分離置PVDF膜，將三種目的蛋白進(jìn)行切割，分別孵育三種抗體，包括SFRP1、DKK1以及內(nèi)參抗體β-actin。用TBST漂洗一抗孵育后的PVDF膜和HRP標(biāo)記的山羊抗兔血清(二抗)，運(yùn)用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影，用ChemiScope mini化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)、拍照。采用Image J軟件檢測(cè)目的條(SFRP1、DKK1)及內(nèi)參條(actin)的灰度值，兩者比值即為蛋白表達(dá)的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度。比較各組間SFRP1及DKK1相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的差異。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 牙齦組織HE染色

鏡下觀察，健康組：鏡下見(jiàn)復(fù)層鱗狀上皮，皮下固有層纖維結(jié)締組織內(nèi)少量慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)明顯異常；CP組：鏡下見(jiàn)復(fù)層鱗狀上皮，部分變薄，表面糜爛、潰瘍形成，部分棘層肥厚，釘突增生，部分網(wǎng)狀增生，皮下固有層纖維結(jié)締組織內(nèi)大量慢性炎細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞)浸潤(rùn)伴纖維肉芽組織增生，局灶可見(jiàn)較多中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

2.2 免疫組織化學(xué)試驗(yàn)測(cè)定各組SFRP1與DKK1的定位與陽(yáng)性表達(dá)情況

鏡下觀察，健康組牙齦組織鱗狀上皮SFRP1和DKK1蛋白少見(jiàn)淺黃色顆粒狀，表達(dá)弱，陽(yáng)性表達(dá)少；中度CP組和重度CP組牙齦組織均見(jiàn)淺黃色顆粒狀。分析發(fā)現(xiàn)，DKK1和SFRP1著色強(qiáng)度積分中度CP組中高于健康組，重度CP組高于輕度CP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖2、圖3。

表1 各組牙齦組織中SFRP1和DKK1著色強(qiáng)度積分比較M(P25，P75)

2.3 牙齦組織WB實(shí)驗(yàn)

健康組中的SFRP1及DKK1在牙齦組織中的表達(dá)水平均比CP組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表2。

表2 SFRP1和DKK1在牙齦組織中的表達(dá)水平分析

3 討論

有研究[9]發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路與骨的發(fā)育和代謝密切相關(guān)，誘導(dǎo)間質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化，促進(jìn)或抑制成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖與分化。同時(shí)有研究[10]在不同的微環(huán)境下Wnt信號(hào)通路調(diào)控牙周膜干細(xì)胞上的成骨分化，炎癥因子的表達(dá)增高，加重牙周組織的破壞。

SFRP1、DKK1通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抑制Wnt通路，成為Wnt經(jīng)典信號(hào)通路重要的抑制劑，可以阻止 Wnt蛋白的下行轉(zhuǎn)導(dǎo)，阻礙成骨細(xì)胞的活動(dòng)，抑制骨的形成[11]，廣泛應(yīng)用于研究。有研究[12]指出牙周炎患者血清中SFRP1高表達(dá)狀態(tài)時(shí)與牙周破壞程度呈正相關(guān)，并隨著破壞程度的加重而逐漸升高。本研究結(jié)果顯示，輕度CP組的SFRP1陽(yáng)性積分值、蛋白表達(dá)水平均高于正常組，重度CP組高于輕度CP組。證明此蛋白作為分泌型蛋白可能通過(guò)在血液中的擴(kuò)散等途徑影響牙周炎的發(fā)展。在Li等[13]研究中，SFRP1蛋白在牙周中與成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞凋謝有關(guān)，此蛋白的高表達(dá)可能促使與牙周成骨細(xì)胞表達(dá)相關(guān)基因沉默，從而引起成骨細(xì)胞的凋亡，造成牙周炎中牙槽骨的缺損流失。

研究[14]發(fā)現(xiàn)DKK1在牙周膜干細(xì)胞中的表達(dá)降低，可激活Wnt信號(hào)通路，引發(fā)牙周膜上的成骨干細(xì)胞分化不全，骨質(zhì)降低。其他研究[15]發(fā)現(xiàn)CP組齦溝液中DKK1濃度高于對(duì)照組，且隨著牙周的發(fā)展，DKK1的分泌亦增加，提示DKK1與慢性牙周炎的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，輕度CP組的DKK1陽(yáng)性積分值、蛋白表達(dá)水平高于正常組，重度CP組高于輕度CP組。查閱資料可知DKK1可以作為Wnt通路的抑制劑，能有效抑制骨形成，促進(jìn)破骨細(xì)胞作用導(dǎo)致骨的破壞。DKK1蛋白在骨的代謝中扮演非常重要的作用。這也提示此蛋白在牙周炎發(fā)展過(guò)程中，面臨牙槽骨缺損流失的可能作用機(jī)制是與它可以抑制Wnt通路有關(guān)。其他實(shí)驗(yàn)[16]在健康對(duì)照組齦溝液中亦檢測(cè)到少量的DKK1蛋白，說(shuō)明DKK1也參與牙齦正常生理狀態(tài)的維持。

綜上所述，本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)慢性牙周炎患者牙齦組織中SFRP1和DKK1的表達(dá)，結(jié)果表明兩者蛋白表達(dá)均高于健康對(duì)照組，且重度CP組高于中度CP組。SFRP1和DKK1蛋白表達(dá)與抑制Wnt通路有關(guān)，體內(nèi)SFRP1和DKK1蛋白高表達(dá)可能會(huì)引起牙周炎的牙槽骨損害。