血清檢測miR-221及miR-27b 對慢性心力衰竭患者診斷及預后的評估價值

朱鎖梅，丁海琴，徐燕濡

(南通大學附屬如皋醫院 急診科, 江蘇 南通 226500)

慢性心力衰竭(chronicheartfailure，CHF)是多種心臟疾病的終末期綜合征，近年來，該病的發病率逐年增加，且此病在發展中常伴有動脈硬化等，死亡率高[1-2]，目前對CHF的診斷準確率較低，影響患者的治療并加大治療難度[3]。研究發現，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)在多種心肌疾病中特異性表達，如冠心病、心肌肥厚、心肌梗死等[4]。微小核糖核酸-221(microRNA-221，miR-221)、微小核糖核酸-27b(microRNA-27b，miR-27b)屬于miRNA家族，miR-221在機體內廣泛存在，參與腫瘤的產生及發展全過程，與心腦血管疾病也有一定的聯系，影響動脈硬化、心肌梗死等疾病的產生及發展[5]。雖然對miR-27b促進心肌肥大機制并沒有達到共識，但在細胞實驗中發現與miR-27b共培養的心肌細胞明顯比沒有加入miR-27b培養的心肌細胞肥大；在病毒性心肌炎動物模型中也發現了抑制miR-27b表達后可減少心肌細胞凋亡[6]。目前已有研究miR-221、miR-27b的表達水平 在冠心病、心肌缺血再灌注、心肌肥厚、心肌梗死的診斷中具有較高的價值[7]。本研究血清miR-221及miR-27b表達水平對CHF患者診斷及預后的評估價值。

1 對象與方法

1.1 一般資料

將2017年1月—2019年1月接受治療的CHF患者120例作為CHF組，其中男69例、女51例，平均(63.48±5.22)歲；另取20例健康志愿者作為對照組，其中男16例、女14例，平均(61.32±6.18)歲。本次實驗獲醫院醫學倫理委員會審批(批號20200214)，患者及家屬對本次實驗知情并同意。CHF組納入標準：(1)符合疾病診斷標準[8]，臨床癥狀表現為休息或運動時出現呼吸困難、乏力、雙下肢浮腫、納差、尿少甚至無尿等，以勞力性氣促、浮腫為典型臨床表現；(2)經血液N末端B型利鈉肽原、血肌酶、血常規、肝腎功能、電解質檢測，心電圖、胸部X線、心臟多普勒超聲及心臟核磁共振檢查確診為CHF患者；(3)意識清晰；(4)無免疫相關疾病者。CHF組排除標準：(1)急性冠脈綜合征;(2)患有甲狀腺功能亢進性心臟病、圍產期心肌病、心肌致密化不全等疾病;(3)嚴重瓣膜性心臟病者;(4)感染性疾病者;(5)肝腎功能不全者。

1.2 研究方法

1.2.1檢測血清miR-221、miR-27b水平 取CHF入院當天及對照組被檢者空腹靜脈血5 mL，800 r/min離心5 min。trizol 試劑提取總RNA，通過MiR Base數據庫獲取微小miR-221、miR-27b相關成熟序列，設計引物，采用實時熒光定量法檢測miR-221、miR-27b純度和濃度，用2-ΔΔCt計算miR-221、miR-27b的相對表達量，試劑盒武漢致眾科技股份有限公司生產。

1.2.2CHF不同心功能分級患者的miR-221、miR-27b水平 120例CHF患者按照心功能NYHA分級[16]分為Ⅰ～Ⅳ 級，其中Ⅱ級32例、Ⅲ 級59例、Ⅳ 級29例，檢測CHF不同心功能分級患者miR-221、miR-27b水平，檢測方法同1.2.1。

1.2.3CHF不同心功能分級與miR-221、miR-27b的相關性 采用皮爾森相關系數分析CHF不同心功能分級與miR-221、miR-27b相關性。

1.3 CHF患者臨床資料單因素分析

收集并記錄120例CHF患者吸煙史、高血壓史、冠心病史及糖尿病史等各項資料，對患者預后進行分析。

1.4 Logistic回歸分析及預后效能分析

對CHF患者的預后生存進行微信、電話、門診復診等方式隨訪，隨訪時間為2019年1月—2020年12月，記錄CHF患者的生存率，并根據患者生存情況分為存活組與死亡組進行單因素分析、多因素分析及預后效能分析，同時分析miR-221、miR-27b對CHF患者預后診斷效能。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 血清中miR-221、miR-27b的表達

與對照組比較，CHF組患者血清中miR-221、miR-27b水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：(1)與健康組比較，P<0.05。

2.2 miR-221、miR-27b在CHF不同心功能分級患者中的表達

血清中miR-221、miR-27b在心功能Ⅱ 級患者中的表達低于Ⅲ 級患者，Ⅲ 級患者中的表達低于Ⅳ 級患者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 miR-221及miR-27b在CHF不同心功能分級患者中的表達

2.3 miR-221、miR-27b與CHF不同心功能分級患者的相關性

相關性結果顯示，血清中miR-221、miR-27b表達與CHF患者心功能分級呈正相關，差異有統計學意義(P<0.05)，提示miR-221、miR-27b水平隨CHF患者心功能下降而升高。見表2。

表2 CHF患者血清miR-221、miR-27b與心功能分級相關性

2.4 影響CHF患者死亡的單因素分析

2年的隨訪結果顯示，將 120例CHF患者中死亡的28例患者(23.33%)分為死亡組，存活的92例(76.67%)患者分為存活組，并進行單因素分析。結果顯示，120例CHF患者在性別、糖尿病史、吸煙史等資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)；在高血壓史、冠心病史、心功能分級及腎損傷中比較，差異有統計學意義(P<0.05)；與存活組比較，死亡組患者血清中miR-221、miR-27b表達顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 影響CHF患者死亡的單因素分析

2.5 影響CHF患者死亡的多因素分析

多因素分析結果顯示，心功能分級、血清miR-221、miR-27b水平是影響患者死亡的獨立風險因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響CHF患者預后的多因素分析

2.6 miR-221、miR-27b對CHF患者預后效能的評估價值

miR-221與miR-27b靈敏度及特異度較好，對CHF疾病預后具有較高的診斷價值。見圖3、表5。

圖2 miR-221、miR-27b診斷CHF患者預后的ROC曲線

表5 miR-221、miR-27b對CHF患者預后的評估價值

3 討論

多種疾病的產生及發展中都有異常表達的miRNA參與其中。miRNA相關成員可從細胞中被釋放至血液中，并跟隨血液進行循環，因此可成為多種疾病診斷及預后的標志，根據早期的診斷進行治療，減少患者2年內死亡率。大量報道提示[9]，miRNA通過調控心肌細胞的凋亡、肥大等參與CHF的產生及發展。郭美姿等[10]運用85例冠心病患者進行實驗發現，miR-221在冠心病患者體內表達異常升高，并與冠心病患者心功能分級呈正相關關系，對該病的診斷及預后具有一定價值。心衰的發生、發展是一個復雜的病理生理過程，心肌肥厚在早期起到了重要的代償作用。前期實驗研究已經證實mir-221的過度表達誘導體外心肌細胞肥大，miRNA對心臟重塑的調節至關重要[11]。M Su等[12]在實驗中證實了，mir-221在小鼠體內的心臟中特異性過度表達，導致了心臟功能障礙和心力衰竭，表現為嚴重的心臟增大、間質纖維化增加和心功能受損，同時還表明mir-221是心臟穩態和重構的重要調節因子，是治療心力衰竭的潛在靶點。孫健俊等[13]運用67例病毒性心肌炎患兒進行研究發現，在病毒性心肌炎中miR-221表達顯著高于健康兒童，并與心肌損傷呈正相關。在體外培養心肌細胞的實驗中，于心肌細胞中轉染miR-221mimics或miR-221siRNA研究其對心肌細胞凋亡的影響發現，轉染miR-221mimics后凋亡增加，轉染miR-221siRNA后可顯著抑制凋亡[14]。本實驗顯示，miR-221在CHF患者中異常高表達。此外，ROC曲線結果提示miR-221對CHF的靈敏度為89.36%、特異度為74.53%，具有一定的診斷價值；相關性結果同樣證實了miR-221表達與心功能分級呈正相關。這提示，miR-221可能是CHF患者的血清標志物。miRNA可調控基因的表達。miRNA的研究已經在血液系統、消化系統、腫瘤、心腦血管等眾多領域取得了突破性進展。miRNA 中 miRNA-27 家族分miRNA-27a、miRNA-27b兩種亞型，它與多種疾病的發展有關，尤與腫瘤的發生、骨的代謝及心腦血管病聯系密切[15]。王燕等[16]在研究中提出，miR-27b在老年左心室肥厚患者中異常高表達，并通過ROC曲線證實，其對心肌肥厚具有一定的診斷價值。劉剛等[17]運用大鼠建立病毒性心肌炎，并給予miR-27b抑制劑干預發現，低表達的miR-27b可抑制心肌細胞凋亡。Ellis K L等[18]運用32例CHF患者進行分析，發現miR-27b對CHF的特異度及靈敏性均較高，對該病具有一定的診斷價值。上述結論均證實了miR-27b在心血管疾病中，尤其是心臟疾病中具有重要的治療作用。為了證實其的診斷價值，本研究運用RT-PCR檢測了miR-27b表達發現，miR-27b水平在CHF患者體內異常升高。此外，ROC曲線面積結果顯示miR-27b對CHF的靈敏度為92.24%、特異度為72.68%，具有一定的診斷價值。這提示，miR-27b可能是CHF患者的血清標志物。

為了進一步研究miR-221、miR-27b對CHF患者預后的影響，本實驗研究了影響CHF患者死亡的風險因素發現，高血壓史、冠心病史、心功能分級、腎損傷、miR-221、miR-27b是影響CHF患者死亡的風險因素，其中心功能分級、miR-221、miR-27b是影響CHF患者預后的獨立風險因素。這提示了，miR-221、miR-27b表達對CHF患者具有一定的預后價值。此外，pearson相關性分析提示miR-221、miR-27b與心功能分級呈正相關關系，進一步證實了miR-221、miR-27b對CHF預后的影響。已有研究證實miR-221、miR-27b對心肌肥厚、心肌炎、心肌梗死等的診斷及預后具有一定的價值，雖然關于其在心力衰竭中的研究較少，但在本研究中，明確檢測miR-221、miR-27b在CHF中異常高表達。這提示miR-221、miR-27b對CHF均具有一定的診斷價值，且其水平影響患者的預后。

綜上所述，在CHF中miR-221、miR-27b為異常高表達，與患者的心功能分級呈正相關關系，及時的檢測miR-221、miR-27b有助于對CHF的診斷并改善預后。