抑制AngⅡ受體對糖尿病腎病的作用及JAK2/STAT3/SOCS1通路的影響

陸萍，蔡珣，石向麗, 冉江華，李愛紅

(南通大學附屬如皋醫院 血液科, 江蘇 南通 226500)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是長期高血糖導致腎損害的結果，是糖尿病微血管并發癥之一，又稱為糖尿病性腎小球硬化癥，是以進行性蛋白尿、高血壓和進展性腎衰竭為特征的一組臨床綜合征[1-2]。雖有研究表明，隨著糖尿病健康管理的加強，與糖尿病相關的心血管疾病的發病率逐漸降低，但這些對終末期腎病發生率的影響較小[3]。目前臨床上治療DN常采用血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)受體拮抗藥物[4-5]，其中血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)是目前研究最透徹的受體[6]。研究發現，AT1R拮抗劑聯合中藥免疫抑制劑對早中期的DN有一定的臨床療效[7]，但關于單獨使用AT1R拮抗劑對DN的作用機制報道較少。Janus激酶/信號轉導和轉錄活化因子(jauns kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信號通路參與多種慢性炎癥性疾病的發生發展[8]。研究發現，細胞因子信號抑制因子(suppressor of cytokine cignaling，SOCS)是JAK/STAT信號通路中重要的負性調控蛋白之一[9]，可介導多種疾病的發生發展。有文獻顯示，SOCS1能通過抑制JAK2的活性誘導STAT3發生磷酸化，進而發揮生物學作用[10]。本研究通過用血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑干預糖尿病腎病大鼠，觀察其通過調控JAK2/STAT3/SOCS1信號通路對DN大鼠的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 雄性SD大鼠均從青島市實驗動物和動物實驗中心購買，共計35只，動物許可證號SCXK(魯)2016-0002。大鼠均為SPF級，體質量200～220 g，所有大鼠飼養在統一的動物房內，保持室內溫度20～25 ℃，光照12 h循環1次，大鼠自由飲食飲水。

1.1.2試劑和儀器 纈沙坦(南京長澳制藥有限公司，批號180925)，小鼠抗JAK2單克隆抗體、兔抗p-JAK2多克隆抗體(美國Millipore公司)，STAT3抗體、p-STAT3抗體(上海博湖生物科技有限公司)，兔抗SOCS1多克隆抗體(美國Immunoway公司)，DAB顯色試劑盒(武漢博爾夫生物科技有限公司)，NAW1-XTY5血糖測定儀[博邦方舟醫療科技(北京)有限公司]。

1.2 研究方法

1.2.1動物分組和DN模型制備 將35只實驗大鼠隨機分為3組，即NC組(健康大鼠不做任何干預，正常飼養)10只，DN組(糖尿病腎病大鼠模型組)和ARB組(DN組基礎上灌胃纈沙坦干預治療)共25只。將DN組和ARB組大鼠制備DN模型，大鼠均用高脂高糖飼料喂養4周后，大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)用0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液pH4.4配制(劑量為30 mg/kg)；4周后，連續3次測定大鼠隨機血糖值，結果>16.7 mmol/L且24 h蛋白尿≥30 mg/L即為造模成功；造模后有5只大鼠造模失敗剔除，剩余20只大鼠每組10只。造模成功后，NC組和DN組大鼠均灌胃等體積的生理鹽水，ARB組大鼠灌胃40 mg/kg·d纈沙坦干預，各組大鼠均連續干預8周。

1.2.2生化指標檢測 灌胃第8周末收集各組大鼠尾尖血，置于離心機離心10 min(3 000 r/min)，收集上層血清，血糖測定儀測定各組大鼠空腹血糖(first fasting blood glucose，FBG)，測定血清中三酰甘油(triglyceride，TG)、血肌酐(Serum creatinine，Scr)，血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平；同時分別用代謝籠收集大鼠24 h尿液，測定大鼠24 h尿蛋白總量(24-hour urine total protein quantity，24 hUTP)和尿微量白蛋白(Urine micro albumin，UmALB，全自動生化分析儀)。

1.2.3腎組織形態學觀察 取血尿后標本后，處死各組大鼠并取出腎皮質，置于甲醛溶液中固定、脫水、石蠟包埋組織，將組織切成4 μm 薄片HE染色，顯微鏡下觀察組織學變化。

1.2.4蛋白質印跡檢測腎皮質組織勻漿 中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS1蛋白表達 取出腎皮質組織，冰上裂解并研磨組織呈組織勻漿，用BCA法測定總蛋白濃度。電泳蛋白樣品，后轉移至PVDF膜轉上，用5%的脫脂奶粉封閉2 h，用PBS稀釋后添加一抗JAK2(1∶1 000)、p-JAK2(1∶1 000)、STAT3(1∶1 000)、p-STAT3(1∶1 000)、SOCS1(1∶1 000)、GAPDH(1∶500)抗體，4 ℃環境孵育過夜，TBST緩沖液洗膜，20 min/次，共3次；加入PBS稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗IgG(1∶5 000)室溫孵育1.5 h。洗膜樣品后用顯微鏡觀察蛋白條帶灰度值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 FBG、TG水平

與NC組比較，DN組大鼠血清FBG和TG水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與DN組比較，ARB組大鼠FBG和TG水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為大鼠FBG水平，B為大鼠TG水平；(1)與NC組比較，P<0.05；(2)與DN組比較，P<0.05。

2.2 Scr、BUN水平

與NC組比較，DN組大鼠血清中Scr、BUN水平均顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與DN組比較，ARB組大鼠血清中Scr、BUN水平均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：A為大鼠Scr水平，B為大鼠BUN水平；(1)與NC組比較，P<0.05；(2)與DN組比較，P<0.05。

2.3 UmALB、UTP水平

與NC組比較，DN組大鼠血清中UmALB、UTP水平顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與DN組比較，ARB組大鼠血清中UmALB、UTP水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

注：A為大鼠UmALB水平，B為大鼠UTP水平；(1)與NC組比較，P<0.05；(2)與DN組比較，P<0.05。

2.4 腎皮質組織學觀察

與NC組比較，DN組大鼠腎小球體積增加，系膜細胞數量變多，腎小球上皮細胞形成大量空泡；與DN組比較，ARB組大鼠腎小球形態區域正常，基底膜輕微增生，腎小管排列區域整齊，病變程度模型減輕。見圖3。

圖4 各組大鼠腎皮質組織學特點(HE，×200)

2.5 腎皮質組織勻漿中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS1蛋白表達

與NC組比較，DN組大鼠腎皮質組織中p-JAK2/JAK2比值和p-STAT3/STAT3比值明顯升高，SOCS1蛋白表達顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與DN組比較，ARB組大鼠腎皮質組織中p-JAK2/JAK2比值和p-STAT3/STAT3比值顯著降低，SOCS1蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，說明AT1R拮抗劑可影響DN大鼠腎皮質組織中JAK2/STAT3/SOCS1蛋白表達水平。見圖5。

注：A為大鼠腎皮質組織中p-JAK2、JAK2蛋白表達，B為大鼠腎皮質組織中p-STAT3、STAT3蛋白表達，C為大鼠腎皮質組織中SOCS1蛋白表達，D為p-JAK2/JAK2，E為p-STAT3/STAT3，F為SOCS1蛋白表達；(1)與NC組比較，P<0.05；(2)與DN組比較，P<0.05。

3 討論

DN是眾多糖尿病并發癥中最常見且最嚴重的并發癥糖尿病(DM)，其以血管損傷所致腎小球病變為主要病理特征[11]。有學者研究發現，控制糖尿病腎病患者血糖，改善血流動力學變化，不僅能有效延緩微量蛋白尿的發生，而且還能減少已有微量蛋白尿患者的臨床蛋白尿癥狀[12]。研究發現，腎素血管緊張素系統(RAS)的激活可導致足細胞損傷，抑制RAS激活對足細胞損傷具有保護作用[13]，進而能有效延緩DN的進展。AngⅡ作為腎素血管緊張素系統的主要效應因子，其在機體血容量、血流動力學及內環境穩態的調節中發揮主導作用，目前已有研究發現，AngⅡ水平在腎內局部升高，其與高血壓、糖尿病時腎臟病變的發生發展密切相關[14]。因此本研究采用AngⅡ拮抗劑干預DN模型大鼠，觀察其對大鼠的作用機制及相關信號通路的影響。

高糖可通過誘導大鼠腎病病變而降低腎小球的濾過功能，抑制腎功能指標Scr、BUN等的吸收。糖尿病腎病發生過程中伴隨著異常的脂質代謝，有學者通過對DN大鼠研究發現，腎小管中有大量的脂質沉淀，通過下調脂質生成基因的表達可減輕糖尿病腎病大鼠的腎損傷[15]。本研究結果顯示，DN組大鼠FPG、TG、Scr、BUN、UmALB、UTP水平升高，提示DN模型制備成功。通過給予大鼠AngⅡ拮抗劑發現，AngⅡ拮抗劑對糖尿病腎病大鼠腎組織損傷有一定修復作用。研究發現，AngⅡ能有效的改善腎小球濾過膜通透性，且AngⅡ能和結合其受體，通過減少濾過膜負電荷起到減弱電荷的屏障作用，進而改變腎小球濾過膜的通透性[16]。

JAKs是STATs信號轉導通路上游激酶，其可激活JAKs表達，通過誘導STATs磷酸化而形成STATs二聚體，進而調控核內的基因表達。當JAK/STAT途徑被過度激活時，靶細胞的生物學功能會因異常活躍而損傷機體，因此通過抑制JAK/STAT途徑的過度激活對維持機體的穩定性有重要作用。SOCS家族是目前研究最多的負性調節因子之一，通過負反饋調節JAK/STAT途徑而減輕機體產生過度的免疫反應，一定程度阻止了疾病的進展，同時對組織損傷有一定改善作用。SOCS1能通過其特異性酶活性抑制區域與JAK2相應催化部位結合，從而抑制信號傳導，目前SOSl對JAK2/STAT3信號通路的負調控作用已被證實。研究發現，SOCS1能抑制JAK2誘導的STAT3磷酸化，進而發揮生物學作用[17]。本研究結果顯示，AngⅡ受體拮抗劑可抑制DN大鼠腎皮質組織中JAK2/STAT3信號通路，提高SOCS1蛋白表達水平，對腎組織具有保護作用。有研究證實，SOCSl可通過負向調節JAK2/STAT3通路抑制STAT3磷酸化的生成，機體中的SOCS1含量隨著疾病的加重而增加，進而一定程度減輕炎癥損傷[18]。目前，尚無相關文獻證實AngⅡ受體拮抗劑可調控JAK2/STAT3/SOCS1信號通路，因此，后續本研究將完善實驗內容，通過更多的實驗方案證實AngⅡ與JAK2/STAT3/SOCS1表達的相關性。

綜上所述，AngⅡ受體拮抗劑能減輕糖尿病腎病大鼠腎損傷，影響JAK2/STAT3/SOCS1蛋白的表達水平，對腎組織有保護作用，為臨床治療糖尿病腎病提供實驗依據。