血管內皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子在腰椎間盤突出組織中的表達及意義*

潘媚，朱義芳，巫娟

(1.四川省骨科醫(yī)院 病理科，四川 成都 610041；2.四川省骨科醫(yī)院 檢驗科，四川 成都 610041)

腰椎間盤突出(LDH)是骨科的常見病，主要來自于腰椎間盤退行性病變，髓核突出刺激、壓迫硬膜囊及相關神經，導致腰腿疼痛和神經功能障礙[1]。多數LDH患者傾向于保守治療，追蹤部分LDH患者發(fā)現，腰椎突出組織會逐漸縮小或消失，目前關于LDH突出組織自發(fā)性吸收機制尚未完全闡明。隨著分子生物學的發(fā)展，相關研究顯示，在LDH組織自發(fā)性吸收過程中，血管化現象與突出組織吸收程度及預后關系密切[2]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是誘導新生血管形成的常見因子[3-4]，由此推斷2者可能參與LDH自發(fā)性吸收過程，目前此類研究多在動物模型中開展，在人體中研究較少[5]。本研究以48例LDH患者為研究對象，探究VEGF、bFGF在突出椎間盤中的表達及相互關系，分析其與椎間盤自發(fā)性吸收的關系，以期為臨床非手術治療LDH提供新依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年10月—2021年8月行LDH手術取得的腰3～骶1段椎間盤組織48例，作為觀察組，納入標準：(1)標本經后路手術獲取;(2)患者符合《腰椎間盤突出癥診療指南》[6]中關于LDH診斷標準;(3)經影像學檢查證實。排除標準：(1)存在心腦血管疾病、肝腎功能嚴重不足患者;(2)存在腰椎骨折、脊柱結核、脊柱腫瘤腫瘤等患者;(3)行硬膜外腔封閉、化學溶核、經皮髓核切吸術治療及二次手術者。另選因椎體骨折經手術切開復位治療所獲得的胸9～腰2段正常椎間盤組織8例作為對照，排除椎管手術史、椎間盤突出或組織變性者。根據術中觀察后縱韌帶是否完整，將獲得的椎間盤組織病理類型分為破裂型(后縱韌帶破裂)和非破裂型(后縱韌帶完整)。觀察組中破裂型24例、非破裂型24例。

1.2 研究方法

所獲取組織均采用10%甲醛固定，常規(guī)梯度濃度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋后連續(xù)切片，切片厚度4 μm。

1.2.1顯微鏡觀察椎間盤組織結構 采用HE染色，二甲苯脫蠟10 min(2次)，梯度酒精脫水，蘇木素染色5 min，流水沖洗，1%鹽酸溶液分化30 s，流水沖洗，1%氨水泛藍30 s，蒸餾水沖洗1 min，伊紅染色2 min，流水沖洗，常規(guī)脫水、透明、封片、中性樹膠封片。由 2 名病理科醫(yī)生采用LOGENE-Ⅰ醫(yī)用圖像處理系統(tǒng)觀察顯微鏡下椎間盤組織結構，判斷是否軟骨細胞增生、血管新生、纖維增生及炎細胞浸潤等。

1.2.2免疫組織化學法檢測椎間盤組織中VEGF和bFGF的表達水平 采用pH 6.0檸檬酸修復液對石蠟切片進行脫蠟及脫水，熱抗原修復、血清封閉10 min、加一抗(1∶100)孵育、4 ℃過夜，加入二抗37 ℃孵育30 min、DAB顯色、蘇木素復染、脫水透明、中性膠封片。VEGF、b-FGF 的表達主要定位于細胞質，表現為棕黃色顆粒狀染色，高倍鏡下隨機選取 5 個>100 個細胞的視野，取平均值。染色強度判定：無染色為0分、淡黃色或僅個別細胞黃至棕黃色為1分、黃至棕黃色為3分、介入兩者之間為2分，陽性細胞百分比<5%為0分、5%～25%為1分、25%～50%為2分、50%～75% 為3分、≥75%為4分；兩項評分乘積作為VEGF、b-FGF表達程度的判讀依據，≤3分為陰性，≥4分為陽性[7]。

1.3 統(tǒng)計學分析

數據采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行分析。計數資料采用率(%)表示，組內比較采用McNemar檢驗，組間比較采用χ2檢驗。bFGF和VEGF表達的相關性分析采用Spearman秩相關分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

觀察組，男32例、女16例，年齡18～71歲、平均(44.94±13.49)歲，病程(以腰痛開始計算)1～72月、平均(11.98±15.87)月。對照組，男1例、女7例，年齡50～81歲、平均(47.88±10.04)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

2.2 腰椎間盤組織學改變

HE染色結果顯示，對照組可見正常腰椎間盤的髓核及纖維環(huán)內外層結構，軟骨細胞形態(tài)規(guī)則，基質稀少均勻，未見新生血管形成；觀察組可見軟骨細胞及纖維增生，基質增多、排列紊亂、炎性細胞浸潤，17例見新生血管(圖1)。

注：A為對照組軟骨細胞形態(tài)規(guī)則、基質稀少均勻，B為觀察組軟骨細胞增生、基質增多，C為觀察組血管增生。

2.3 VEGF、bFGF陽性表達

免疫組織化學結果顯示，對照組腰椎間盤組織中未見VEGF、bFGF陽性表達，觀察組腰椎間盤組織中VEGF陽性33例(68.75%)、bFGF陽性41例(85.42%)，VEGF主要在血管內皮細胞、纖維細胞及軟骨細胞中表達，bFGF主要在軟骨細胞及血管內皮細胞中表達。見圖2。

注：A為對照組VEGF未見表達，B為觀察組VEGF在軟骨細胞中表達，C為觀察組bFGF在血管內皮細胞中表達。

2.4 不同病理類型和病程的LDH患者腰椎間盤組織中VEGF和bFGF陽性表達

結果顯示，破裂型LDH患者腰椎間盤組織中VEGF陽性總表達率(87.5%)高于非破裂型(50%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；破裂型和非破裂型LDH患者腰椎間盤組織中bFGF陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。不同病程中，患者病程>12個月的破裂型LDH腰椎間盤組織中VEGF陽性表達率(75%)高于非破裂型(12.5%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其余病程破裂型和非破裂型LDH腰椎間盤組織中VEGF陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同病程的LDH患者腰椎間盤組織中VEGF和bFGF陽性表達[n(%)]

2.5 LDH患者的腰椎間盤組織中VEGF和bFGF陽性表達的相關性分析

經McNemar檢驗發(fā)現，VEGF陽性靈敏度(31/33=93.94%)高于bFGF陽性靈敏度(31/41=75.61%)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.083，P=0.039)。經Spearman秩相關分析發(fā)現，LDH患者的腰椎間盤組織中bFGF與VEGF表達呈顯著正相關關系(rs=0.358，P=0.012)。

3 討論

突出椎間盤自發(fā)性吸收是LDH患者在未經化學溶核、外科手術干預情況下發(fā)生的突出組織自發(fā)性消失或縮小現象[8]。隨著MRI的廣泛應用，國內外有關LDH突出組織自發(fā)性吸收的臨床報告日益增多，證實自發(fā)性吸收現象客觀存在，這對手術治療LDH提出了更為嚴格的適應證[9-10]。目前關于突出椎間盤自發(fā)性吸收的機制越來越明晰，包括新生血管形成、炎癥免疫反應、機械壓力、細胞自噬與凋亡等多種因素，但具體發(fā)生過程及如何激活相關機制仍尚未完全闡明[11]。本研究從新生血管形成因素入手，了解新生血管形成過程中相關因子的表達，以期為優(yōu)化臨床LDH治療方案提供新的方向。

正常成年椎間盤髓核及纖維環(huán)是體內最大的無血管組織，髓核所需營養(yǎng)物質主要經軟骨終板和纖維環(huán)滲透進入，LDH患者進入硬膜外腔的突出組織表面可見明顯的新生毛細血管[12-14]。VEGF作為重要的血管生長刺激因子之一，一方面能促進新生血管形成，將炎性細胞募集到炎癥區(qū)域，另一方面通過內皮細胞VEGFR-2受體增加血管通透性，維持炎癥反應過程，促進巨噬細胞的浸潤及吞噬，從而使突出的髓核組織逐漸縮小和消失[15-16]。Pufe 等[17]發(fā)現利用 VEGF可刺激軟骨細胞，顯著上調金屬蛋白酶1(MMP-1)、MMP-13 的表達，下調金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)、TIMP-2 的表達，促進椎間盤退變；采用VEGFR-2 抑制劑可逆轉VEGF 對軟骨細胞的促分解代謝反應，緩解退變進程。bFGF也是促進血管形成的重要因子，通過促進血管內皮細胞分裂及誘導大量的纖維蛋白溶酶原激活劑產生，促使新的毛細血管芽形成。研究顯示，bFGF在突出的髓核組織中呈高表達，且能與炎癥因子腫瘤壞死因子-ɑ相互作用，通過誘導巨噬細胞和提高金屬基質蛋白酶的表達促進突出組織的吸收[18]，注射bFGF 能減少退變早期椎間盤形態(tài)結構的破壞[19]。

本研究中病理組織學檢測對照組未見新生血管形成，觀察組17例見新生血管。免疫組織化學檢測48例LDH組織VEGF、bFGF陽性率分別為68.75%及85.72%，對照組未見VEGF、bFGF陽性表達，破裂型的VEGF陽性總表達率(87.5%)高于非破裂型(50%，P<0.05)，提示新生血管形成是LDH患者突出組織自發(fā)性吸收的重要過程，VEGF、bFGF均參與了突出組織自發(fā)性吸收過程，且破裂型更能反映血管新生及自發(fā)性吸收特點。此外，有研究顯示突出椎間盤組織自發(fā)性吸收主要發(fā)生在發(fā)病后2～12個月，3～6個月時呈顯著性變化，巨大破裂型LDH急性起病時更易發(fā)生自發(fā)性吸收現象[11]。本組研究中病程≤12月破裂型患者VEGF陽性表達率無明顯差異，隨病程延長到12個月以后VEGF陽性表達率降低，但病程>12個月破裂型患者VEGF陽性表達率(75%)仍高于非破裂型(12.5%，P<0.05)；破裂型和非破裂型患者的bFGF陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，bFGF陽性表達性率在7～12個月時開始降低，提示病程≤12月破裂型患者更易發(fā)生突出組織自發(fā)性吸收，且隨病程延長破裂型患者發(fā)生自發(fā)性吸收的可能性仍大于非破裂型患者，同時可推測VEGF表達的降低可能與后期血管缺血及閉鎖有關；而bFGF在整個重吸收過程變化緩慢，可推測其在椎間盤發(fā)育、成熟及退變過程中起持續(xù)作用。除此之外，bFGF能作用于血管壁，通過提高VEGF的蛋白水平，促進血管新生[20]。實驗相關性分析顯示，bFGF和VEGF呈顯著正相關關系(r=0.358，P=0.012)，也驗證了bFGF能促進VEGF的表達。觀察組組織中見炎性細胞浸潤、軟骨細胞增生、基質增多，可能與炎癥反應介導的細胞吞噬、基質金屬蛋白酶的合成與降解失衡等相關，具體機制仍有待進一步研究。

綜上所述，破裂型患者病程≤12月更易發(fā)生突出組織自發(fā)性吸收；VEGF、bFGF均參與了突出椎間盤自發(fā)性吸收過程，且bFGF能促進VEGF的表達，了解兩者在新生血管形成及突出椎間盤自發(fā)性吸收過程中的作用及規(guī)律，有望為非手術治療LDH提供了可靠證據和新的思路。