大麥氣孔發(fā)育相關(guān)基因HvSPCH的克隆及初步功能分析

次爾甲瑪，王宏鵬，茍筱穎，佟可心，郭瑞超，王俊斌，曹高燚，包曙光，謝曉東，陳小強

(天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384)

大麥()是禾本科作物，一年生，具有耐貧瘠、抗旱、抗寒、耐鹽等特點。 其含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，是重要的糧食和飼料作物，還具有藥用價值。氣孔是植物葉表皮上可以調(diào)節(jié)的小孔，其大小、密度、模式及開關(guān)速度等均可影響植物的光合作用、蒸騰作用、碳循環(huán)等生理過程，對調(diào)控植物適應(yīng)環(huán)境方面起著非常重要的作用。大麥屬于單子葉植物，其成熟的氣孔同雙子葉植物氣孔不同，是由兩個啞鈴狀的保衛(wèi)細胞及其兩側(cè)的兩個副衛(wèi)細胞組成，被稱為氣孔復(fù)合體，呈線性排列(雙子葉植物為不規(guī)則排列)。

氣孔的形成與發(fā)育受堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，包含SPCH、MUTE和FAMA三種轉(zhuǎn)錄因子，其中SPCH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控部分植物原表皮細胞進入氣孔發(fā)育系統(tǒng)，發(fā)生不對稱分裂，使擬分生組織母細胞(meristemoid mother cell,MMC)形成擬分生組織細胞(meristemoid cell,MC)；MUTE轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控MC分化為保衛(wèi)母細胞(guard mother cell,GMC)，GMC進行對稱分裂；而FAMA轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控GMC分化為氣孔的保衛(wèi)細胞(guard cell,GC)，并阻止細胞進一步分裂，終止氣孔發(fā)育系統(tǒng)。

植物SPCH轉(zhuǎn)錄因子的功能喪失會對氣孔的間距、密度和位置產(chǎn)生很大的影響，甚至可以改變?nèi)~肉的結(jié)構(gòu)。而一些蛋白酶、受體蛋白和負調(diào)控因子及光、溫等環(huán)境因子會抑制SPCH轉(zhuǎn)錄因子的表達，影響氣孔分裂并最終降低氣孔密度。以上對SPCH轉(zhuǎn)錄因子的功能研究多集中在雙子葉植物擬南芥上，并取得了一些進展。但由于單子葉植物和雙子葉植物的氣孔在形態(tài)、模式、運動和發(fā)育過程上存在差異，推測SPCH轉(zhuǎn)錄因子在兩類植物中的具體功能方面也存在特異性差異。本研究對大麥SPCH轉(zhuǎn)錄因子基因()進行克隆，并對其進行生物信息學(xué)分析，以期揭示大麥乃至禾本科植物中氣孔發(fā)育的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為大麥品種G1614。大麥種子用75%酒精處理1 min，25%的NaClO處理30 min以及30%的HO避光處理30 min后，置于有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，然后放入生長室(溫度24 ℃、濕度70%、光照(光照強度為3 000 lx) 10～14 h)中培養(yǎng)17 h(大麥苗開始生根)，再用30% PEG6000進行干旱脅迫處理，取處理4、12和 20 h的大麥苗葉基部，以相應(yīng)培養(yǎng)時間無干旱脅迫處理的大麥苗葉基部為對照；處理2 d后，取葉基部進行后續(xù)研究。

1.2 方 法

1.2.1 大麥苗總RNA的提取及cDNA的合成

將30% PEG6000處理4、12和20 h的大麥苗葉基部剪下，迅速置于液氮中，快速研磨成粉末狀，使用Plant Total RNA Isolation Kit試劑盒(生工，上海)提取大麥總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外凝膠成像儀檢測其質(zhì)量，用核酸分析儀檢測其濃度。參照Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒(生工，上海)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，于-20 ℃保存，備用。

1.2.2基因的克隆

從NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorg/gorf.html)下載基因序列(ID: HORVU.MOREX.r2.7HG0587740.1)，從NCBI的ORF finder程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找基因的編碼區(qū)序列，然后在Primer 3 Plus網(wǎng)站(https://www.primer3plus.com/index.html)設(shè)計引物ZC-L(5′-ATGGGAGATGCGCTGTGC-3′)和ZC-R(5′-TTATGAGAACGTTTGCTGAATTTCT-3′)，由上海生工生物工程股份有限公司合成。以提取的大麥苗cDNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增體系為20 μL，包括cDNA模板1 μL,引物ZC-L、ZC-R各1 μL，Prime STAR Max Premin 10 μL，ddHO 7 μL。PCR擴增程序：98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸73 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，利用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生工，上海)進行膠回收純化，然后送上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.2.3 HvSPCH蛋白的生物信息學(xué)分析

用NCBI的CDD程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)分析蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。用ProtParam在線軟件(http://wbe.expasy.org/protparam/)分析蛋白的理化性質(zhì)。用TMHMM在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，用SignaIP 5.0在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/index.php/)分析蛋白的信號肽。用Netphos 3.1 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測蛋白的磷酸化位點。用GlycoMine在線軟件(http://glycomine.erc.monash.edu/Lab/GlycoMine/)預(yù)測蛋白的糖基化位點。用SOPMA(https://npsa-parbi.ibcp.fr/)和SWISS-modle(http://swissmodle.expasy.org/interactive)分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。用Plant-mPloc和post prediction(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)在線軟件進行亞細胞定位分析。利用NCBI的BLAST功能(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)下載與HvSPCH蛋白氨基酸相似性較高的同源蛋白序列，用MEGA 7構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 干旱脅迫對基因表達模式的影響

將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA(稀釋 10 倍)作為模板，進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。用Primer 3 Plus網(wǎng)站設(shè)計熒光定量引物(SPCH-F:CCGAAGACTTATTCAGCATCC；SPCH-R:CTCATGCGATATTCCGTCAC)。以大麥為內(nèi)參基因(引物序列為actin-F：TGGATCGGAGGGTCCATCCT；actin-R：GCACTTCCTGTGGACGATCGCTG)，PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括2×UltraSYBR混合液10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板 2 μL，加水補足至20 μL。反應(yīng)程序: 95 ℃ 預(yù)變性10 min；95 ℃ 變性15 s，60 ℃退火 1 min，40 個循環(huán)。PCR反應(yīng)在ABI 7500 Fast qRT-PCR儀上進行，用2-ΔΔ法計算基因的表達量，3 次生物學(xué)重復(fù)，用Excel 軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥幼苗葉基部總RNA的提取結(jié)果

提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果(圖1)顯示，電泳條帶清晰完整，無彌散條帶，且28 S與18 S的亮度比值約為2，表明提取的大麥葉基部總RNA質(zhì)量較好。經(jīng)紫外分光光度計檢測發(fā)現(xiàn)，提取的大麥葉基部總RNA濃度為315 ng·μL，A比值為2，符合試驗要求，可用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄試驗。

圖1 大麥葉基部總RNA的電泳圖Fig.1 Electrophoresis results of total RNA extracted from the leaf base of barley

2.2 HvSPCH基因的克隆結(jié)果

以大麥葉基部總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用特異性引物ZC-L/R進行PCR擴增。結(jié)果(圖2)顯示，在大約1 500 bp處出現(xiàn)特異條帶，與目的基因長度基本一致。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化，送公司測序后獲得一條長度為1 618 bp的序列。通過NCBI的ORF Finder程序?qū)υ撔蛄羞M行分析，結(jié)果表明，該序列包含一個1 098 bp的完整開放閱讀框，可編碼365個氨基酸。此外，在該序列的上游和下游分別含有一段240 bp的5′非翻譯區(qū)和一段280 bp的3′非翻譯區(qū)。

2.3 HvSPCH蛋白的生物信息學(xué)分析

2.3.1 系統(tǒng)進化發(fā)育分析

通過在NCBI上對大麥HvSPCH蛋白和其他物種的SPCH蛋白進行對比，發(fā)現(xiàn)大麥HvSPCH蛋白序列與野生二粒小麥()、二穗短柄草()、水稻()的SPCH蛋白序列相似性較高，相似度在86.30%～95.08%之間。用Mega 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果(圖3)表明，大麥HvSPCH蛋白與小麥、水稻、二穗短柄草的SPCH蛋白親緣關(guān)系較近，而與擬南芥()、高粱()和玉米()的親緣關(guān)系較遠。

2.3.2 理化性質(zhì)及跨膜結(jié)構(gòu)分析

利用Protparam在線軟件對大麥HvSPCH蛋白的理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果表明，該蛋白的分子式為CHNOS，相對分子質(zhì)量為90 504.73 Da，等電點(pI)為4.96，半衰期為4.4 h(體外)，不穩(wěn)定指數(shù)為50.49。該蛋白中半胱氨酸(34.8%)、甘氨酸(30.5%)、丙氨酸(19.95%)、蘇氨酸(14.8%)的含量相對較多，脂肪系數(shù)為19.85，親水性平均系數(shù)為1.001。綜上結(jié)果表明，HvSPCH蛋白屬于疏水、不穩(wěn)定的堿性蛋白質(zhì)。TMHMM和SignalP 5.0軟件分析結(jié)果表明，HvSPCH蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽。

M：2K PlusⅡDNA Maker；1：HvSPCH基因的擴增產(chǎn)物。

2.3.3 保守結(jié)構(gòu)域、亞細胞定位及磷酸化和糖基化位點預(yù)測

利用NCBI的CDD程序?qū)Υ篼淗vSPCH蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有bHLH結(jié)構(gòu)域，屬于bHLH家族成員(圖4)。利用Plant-mPloc進行亞細胞定位，推測大麥HvSPCH蛋白定位于細胞核中。利用Netphos 3.1 server在線軟件對潛在磷酸化位點進行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有27個絲氨酸、12個蘇氨酸和1個酪氨酸位點。利用GlycoMine軟件對糖基化位點進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有7個N-糖基化位點和20個O-糖基化位點。

圖3 大麥HvSPCH蛋白與其他物種SPCH的系統(tǒng)進化樹

圖4 HvSPCH蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

2.3.4 二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

用SOPMA軟件對HvSPCH蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要由α-螺旋、延長鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲四種結(jié)構(gòu)組成，其所占比例分別為35.62%、8.77%、2.47%和53.13%。用SWISS-model對HvSPCH蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)HvSPCH蛋白的三維結(jié)構(gòu)具有αβα模式，即典型的螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)結(jié)構(gòu)(圖5)。

圖5 HvSPCH蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4 干旱脅迫處理下HvSPCH基因的表達模式

qRT-PCR結(jié)果(圖6)表明，對照處理中基因的表達量在各處理時間均較低，而且表達量幾乎一致。在干旱處理條件下基因的表達量隨處理時間的持續(xù)呈先升后降的變化趨勢，在處理12 h時表達量最高，但在處理20 h時表達量又恢復(fù)至對照水平。基因的表達量在干旱處理4 h和12 h顯著高于對照，在干旱處理20 h時與對照無顯著差異。

3 討 論

氣孔是整個植物發(fā)揮功能所需的基本動態(tài)結(jié)構(gòu)，可促進葉片內(nèi)部和外部環(huán)境之間的氣體交換，有助于調(diào)節(jié)溫度和平衡光合需求，防止水分流失和保證CO的動態(tài)平衡。

氣孔細胞系的啟動和增殖由基因控制，基因在葉片中的表達量隨著葉片發(fā)育年齡的增加而降低，且在成熟的葉片中不存在。在雙子葉植物擬南芥的氣孔發(fā)育中，SPCH轉(zhuǎn)錄因子在bHLH類三個轉(zhuǎn)錄因子(SPCH、MUTE和FAMA)中最先表達，可控制MMC向MC的轉(zhuǎn)變。而擬南芥缺失突變體的表皮是鋸齒狀的，氣孔完全缺失，但在胚胎和根中基因的缺失不影響MMC的不對稱分裂，因此，推測基因可特異性調(diào)控氣孔的發(fā)育機制。在單子葉植物中，基因也可通過調(diào)控表皮細胞的不對稱分裂來啟動氣孔發(fā)育途徑，但是根據(jù)單子葉植物和雙子葉植物氣孔在發(fā)育過程和形態(tài)分布上存在差異，推測基因在兩類植物中的具體功能也存在 差異。

*表示干旱處理和對照處理之間HvSPCH基因的表達量差異達顯著水平(P<0.05)。

為進一步了解SPCH轉(zhuǎn)錄因子在禾本科植物中的功能，本研究克隆了大麥基因并進行生物信息學(xué)分析，并對其在干旱脅迫條件下的表達模式進行了研究。生物信息學(xué)分析表明，HvSPCH蛋白屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員，與氣孔初始發(fā)育相關(guān)。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測表明其具有αβα模式，即典型的HLH結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)進化分析表明，大麥HvSPCH蛋白與水稻、小麥、二穗短柄草等禾本科植物的SPCH蛋白同源性較高，親緣關(guān)系較近。

本研究結(jié)果還表明，HvSPCH蛋白共有40個磷酸化位點。前人研究表明，擬南芥SPCH蛋白的穩(wěn)定性和功能與其磷酸化狀態(tài)密切相關(guān)，SPCH蛋白被線粒體活化蛋白激酶(MAPK)、糖原合成酶3激酶(GSK3)和細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)靶向磷酸化，導(dǎo)致SPCH蛋白降解，氣孔分裂減少，從而降低氣孔數(shù)目，說明SPCH蛋白的活性和穩(wěn)定性是通過多種激酶響應(yīng)各種信號的磷酸化來調(diào)控的。此外，N-糖基化在不同層次和不同位點同時參與調(diào)控氣孔發(fā)育。本研究中HvSPCH蛋白有27個糖基化位點，其中N-糖基化位點7個，O-糖基化位點20個。Macalister等研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中缺失N-糖基化關(guān)鍵酶后，bHLH類三個轉(zhuǎn)錄因子(SPCH、MUTE和FAMA)的表達量都顯著提高，且葉片氣孔密度增加，氣孔開放程度增大，但隨著植物的生長，氣孔密度有所下降，并且有異常氣孔簇出現(xiàn)，然而其具體機制尚不清楚。當植物受到干旱脅迫時，氣孔密度增加，氣孔開度減小，部分氣孔迅速關(guān)閉，從而減少蒸騰作用，最終響應(yīng)干旱脅迫。本研究對干旱脅迫處理下大麥基因的表達模式進行分析，結(jié)果表明，干旱處理 4 h和12 h時，基因的表達量顯著提高，說明其有可能通過增加氣孔密度來參與大麥的干旱響應(yīng)過程，這為了解SPCH轉(zhuǎn)錄因子在單子葉植物的功能奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)筆者將繼續(xù)深入研究SPCH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的上、下游基因，以進一步深入闡明氣孔基因的具體功能和調(diào)控機制，為大麥甚至單子葉植物分子育種奠定 基礎(chǔ)。