2019年浙江省部分地區小麥赤霉病菌種群組成及其對殺菌劑的敏感性調查

趙心雨，郭宇燕，張 璐，賴朝暉，黃福旦，胡東維，梁五生

(1.浙江大學農業與生物技術學院生物技術研究所/農業部作物病蟲分子生物學重點實驗室/浙江省作物病蟲生物學重點實驗室，浙江杭州 310058；2.浙江省象山縣農業技術推廣中心，浙江象山 315700；3.浙江省杭州市蕭山區農業技術推廣中心，浙江杭州 311203)

赤霉病(Fusarium head blight)是由赤霉病菌侵染小麥引起的一種常見真菌性病害，可導致麥穗枯萎，在世界范圍內各麥區廣泛發生，可造成小麥嚴重減產。赤霉病菌為一類鐮孢菌復合種，包含禾谷鐮孢菌()、亞洲鐮孢菌()、梨孢鐮孢菌()等多種鐮孢菌，目前已鑒定出23種鐮孢菌。不同的鐮孢菌產生不同的毒素，不同的毒素具有不同的毒性，根據產毒類型可將鐮孢菌產生的毒素分為不同的毒素化學型。此外，不同鐮孢菌的侵染方式、產孢作用以及對殺菌劑的敏感性等均存在差異。由于氣候條件、耕種方式等方面的影響，不同地區赤霉病菌的種群組成可能不同，鑒定不同麥區赤霉病菌菌株的種群組成，可為在氣候變化大背景下調整輪作方式、預測評估風險等提供依據。

小麥是浙江省第二大糧食作物，赤霉病一直嚴重影響浙江省的小麥生產。1954―1977年中，小麥赤霉病中、重病年份占70%以上。2006―2015年間的統計數據顯示，小麥赤霉病在浙江省偏重流行，其中2012、2014和2016年浙江省發生較為嚴重。因此，該病在浙江省長期偏重流行的原因值得深入研究。

對于浙江省小麥赤霉病菌的種群組成，雖然目前已有研究報道，但鑒定時間較早。因此，本研究于2019年對浙江省部分地區小麥赤霉病菌的種群組成進行分析，并調查其對殺菌劑的敏感性，以期為科學防病控病提供依據。

1 材料與方法

1.1 田間稻樁赤霉病菌子囊殼陽性率的調查及其孢子萌發活性的檢測

于2019年3月份，在浙江省3個地區(杭州市蕭山區、杭州市桐廬縣、寧波市象山縣)的麥田，隨機拔取一定數量上一年種植水稻收割后遺留的稻樁，逐一檢查稻樁上是否存在赤霉病菌子囊殼，統計陽性稻樁的數量并計算陽性率。隨機抽取部分陽性稻樁，帶回實驗室，用鑷子夾取若干子囊殼置于載玻片上，擠壓使其破裂，加無菌水懸浮，吸取部分懸浮液涂布于PDA培養基平板上。將載有子囊殼懸浮液的載玻片和涂布子囊殼懸浮液的PDA平板均靜置于25 ℃培養箱中，每隔2 h觀察PDA平板上的菌落生長情況，并用光學顯微鏡觀察載玻片上孢子的萌發情況，檢測子囊殼中孢子的萌發活性。

1.2 田間空氣中赤霉病菌游動孢子數量的調查

于2019年3-5月，在3個地區麥田，取滅過菌的直徑為9.0 cm的培養皿，加適量滅菌水(約7 mL，以淹沒培養皿底部為標準)，開蓋后置于離麥田地面約1.5 m的高度處，捕獲空氣中的赤霉病菌游動孢子。每月調查一次，三次調查中每個地點隨機放置10套培養皿，記錄捕獲時間，2～4 h后蓋好皿蓋，帶回實驗室，在無菌操作臺上先加入適量鏈霉素以防止細菌污染，再加入10 mL PDA固體培養基，然后置于25 ℃恒溫箱中培養，3 d后觀察PDA平板并統計各平板上具有莧菜紅特征的菌落數量，即為捕獲的空氣中赤霉病菌游動孢子數量。

1.3 田間小麥赤霉病病穗率的調查

于2019年4月上旬(4月10日)、中旬(4月16日)和下旬(4月27日)，調查3個地區麥田小麥(以揚麥20、揚麥24為主導品種)的赤霉病病穗率，病穗的判定標準為麥穗上至少有1個麥粒的外殼被明顯漂白。每個地區每次至少調查3個不同田塊，每個田塊至少隨機調查100個麥穗。

1.4 赤霉病菌菌株的分離

于2019年4月，從3個地區的麥田隨機采集小麥病穗，帶回實驗室，參考史文琦等的單孢分離方法，獲得純化菌株，逐一編號、保存。

1.5 赤霉病菌種群組成的鑒定

從分離的小麥赤霉病菌菌株中隨機選擇32個，參考Geiser等的方法，通過比對()基因的序列來鑒定分離到的赤霉病菌菌株的種名。具體方法：先用基因組提取試劑盒(上海生工生物科技有限公司)提取菌株的基因組DNA。然后以基因組DNA為模板，用引物EF-1[5′-ATGGGTAAGGA(A/G)GACAAGAC-3′]和EF-2[5′-GGA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCATGTT-3′]進行擴增。PCR反應體系為20 μL，包含DNA模板1 μL， 2×HieffPCR Master Mix(with Dye)(上海翌圣生物科技有限公司)10 μL，EF-1(10 μmmol·L) 1 μL，EF-2(10 μmmol·L) 1 μL，ddHO 7 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR反應產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收并純化目的片段，送北京擎科生物科技有限公司杭州分公司測序。將所得到的基因序列與NCBI數據庫中的序列進行比對，確定分離到的赤霉病菌菌株的種名。

1.6 赤霉病菌對多菌靈抗性的檢測

參考王建新等的方法，分別配制不含多菌靈和含10 mg·L多菌靈的PDA培養基平板，先用不含多菌靈的PDA平板培養赤霉病菌，然后從菌落邊緣切取菌碟，接種于含多菌靈的PDA培養基平板中央，置于培養箱中在25 ℃下培養 3 d，每個菌株平行重復3皿，在含多菌靈的PDA平板上均能生長的菌株被認定為多菌靈的抗性菌株。

1.7 四種殺菌藥劑有效抑制赤霉病菌中濃度(EC50)的測定

測定的四種殺菌藥劑分別為75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑(拜耳股份有限公司)、40%戊唑·咪鮮胺水乳劑(佛山市盈輝作物科學有限公司)、30%唑醚·戊唑醇懸浮劑(江蘇生久農化有限公司)和25%氰烯菌酯懸浮劑(江蘇省農藥研究所股份有限公司)。參考王建新等的菌落直徑法，測定上述4種殺菌藥劑對分離到的赤霉病菌菌株的EC。每種殺菌藥劑均測定16個分離菌株，包括前期試驗鑒定到的8個多菌靈抗性菌株和8個非抗性菌株。

1.8 殺菌藥劑按不同方案混配后對赤霉病菌抑制效果的比較

利用已測定的EC濃度數值，分別配制含上述4種殺菌藥劑中任意2種的PDA培養基平板，每種殺菌藥劑的濃度是其EC值的50%，共得到6種殺菌藥劑混配PDA培養基平板。然后參考王建新等報道的殺菌藥劑EC值測定方法，并取其所用的16個分離菌株，測定各混配方案對病菌生長的抑制率。

2 結果與分析

2.1 田間稻樁的赤霉病菌子囊殼攜帶率及子囊孢子的萌發活性

2019年3月，小麥拔節期3個地區麥田均可見到稻樁殘留，抽樣調查的結果(表1)顯示，3個地區麥田稻樁的赤霉病菌子囊殼攜帶率有一定差異，變化范圍為26.4%～55.4%，平均值為43.9%。

表1 田間檢出赤霉病菌子囊殼的稻樁百分率Table 1 Percentages of rice stubbles with perithecia of Fusarium spp. in the fields

將稻樁上的赤霉病菌子囊殼擠壓破裂后制備懸浮液，吸取部分懸浮液涂布于載玻片上，用光學顯微鏡可觀察到紡錘形子囊孢子，無色，隔膜為 1～3個，未萌發子囊孢子的長度可達約30 μm(圖1A)。將涂布子囊殼懸浮液的載玻片置于 25 ℃培養箱中培養2 h，可觀察到部分子囊孢子已長出芽管，表明部分孢子已經開始萌發(圖1B)；培養6 h后，部分芽管伸長成菌絲(圖1C)；繼續培養14和18 h，可觀察到從子囊孢子上長出的菌絲進一步伸長(圖1D、1E)。取部分子囊殼制備的懸浮液涂布于PDA平板上，置于25 ℃培養箱中培養2 d，可觀察到具有莧菜紅特征的赤霉病菌菌落(圖1F、1G)。上述孢子萌發試驗結果表明，在合適的條件下，田間稻樁赤霉病菌子囊殼中的子囊孢子能夠正常萌發長出菌絲，菌絲可快速生長形成菌落。

A～E分別為子囊孢子在載玻片上培養0、2、6、14和18 h后的圖片。F和G分別為子囊孢子在PDA平板上培養2 d后形成的菌落正面照片和背面照片。

2.2 田間空氣中赤霉病菌的游動孢子數

2019年3月，每個培養皿平均每小時從3個地區的麥田空氣中捕獲到的赤霉病菌游動孢子數平均值為6.7個；2019年4月和5月捕獲到的赤霉病菌游動孢子數平均值均為1.6個，顯著少于3月(表2)。

2.3 田間小麥的赤霉病病穗率

2019年4月上、中、下旬，調查3個地區田間小麥的赤霉病病穗率，結果(表3)顯示，4月中旬田間小麥開始出現病穗，然后病穗率快速攀升，4月下旬有12.3%的麥穗表現出赤霉病癥狀。

2.4 赤霉病菌的種群組成

從3個地區的小麥病穗中共分離到386個赤霉病菌菌株，隨機選擇32個菌株進行PCR鑒定，結果顯示，32個菌株均可擴增到大小約700 bp的目的片段，其中16個菌株PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2所示。將上述目的片段回收純化后，送北京擎科生物科技有限公司杭州分公司進行測序，結果顯示，檢測的32個分離菌株均為亞洲鐮孢菌()，序列相似度均為100%，表明是3個地區赤霉病菌的優勢種。

2.5 赤霉病菌分離菌株對多菌靈的抗性

對分離到的386個赤霉病菌菌株的多菌靈抗性進行檢測，發現菌株在含10 mg·L多菌靈的PDA平板培養3 d后，314個菌株的菌落未見任何擴展，為非抗性菌株，如圖3中的菌株1、2、3，占所有分離菌株的81.35%；另外72個菌株的菌落有所擴展，為抗性菌株，如圖3中的菌株4、5、6，占所有分離菌株的18.65%。

2.6 赤霉病菌分離菌株對殺菌藥劑的敏感性

選取目前市場主推的4種殺菌藥劑(75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑、40%戊唑·咪鮮胺微乳劑、30%唑醚·戊唑醇懸浮劑、25%氰烯菌酯懸浮劑)對分離到的16個赤霉病菌菌株(8個抗性菌株和8個非抗性菌株)的EC值進行測定，發現8個抗性菌株和8個非抗性菌株的EC值無統計學差異，因此取所有16個分離菌株的EC值平均值作為各殺菌藥劑的EC值。從表4可以看出，75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑和30%唑醚·戊唑醇懸浮劑對分離到的16個赤霉病菌菌株的EC值均低于5.0 mg·L，40%戊唑·咪鮮胺微乳劑和25%氰烯菌酯懸浮劑對分離到的16個赤霉病菌菌株的EC值均低于2.0 μL·L，表明上述4種殺菌藥劑對浙江赤霉病菌株均具有良好的抑菌效果。

表2 不同時期從麥田空氣中捕獲到的赤霉病菌的游動孢子數(2019)Table 2 Number of zoospores of Fusarium spp. trapped from the wheat fields air at different stages(2019)

進一步將上述4種殺菌藥劑進行兩兩混配，然后測定16個赤霉病菌菌株的抑菌效果，結果(表5)顯示，混配方案“75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑”+“30%唑醚·戊唑醇懸浮劑”的抑菌率最高。

表3 不同時期田間小麥的赤霉病病穗率(2019)Table 3 Percentage of diseased spikes with Fusarium head blight in the fields at different stages(2019)

M:DL1500；W：H2O(陰性對照)；1～16：16個分離菌株。

表4 四種殺菌藥劑對赤霉病菌分離菌株的EC50值Table 4 EC50 values of four fungicidal agents to the isolated strains of Fusarium spp.

圖3 分離到的赤霉病菌菌株對多菌靈的抗性表現

表5 四種殺菌劑兩兩混配方案對赤霉病菌菌絲生長的抑制率Table 5 Inhibition rates of pairwise mixing four tested fungicidal agents on the mycelial growth of the isolated strains of Fusarium spp. %

3 討 論

3.1 田間的赤霉病菌子囊孢子的釋放

Karlsson等研究證實，農田殘留物上的孢子是小麥赤霉病重要的侵染源。本研究結果表明，3月份浙江省田間大部分稻樁都攜帶赤霉病菌子囊殼，其釋放的子囊孢子在合適的條件下能快速萌發長成菌落。浙江省地處典型的亞熱帶季風氣候區，四季分明，冬季氣溫偏低，赤霉病菌以子囊殼越冬。到了3月份，浙江省氣溫快速回升，降雨量也比冬季明顯增多，因此子囊殼開始釋放孢子。浙江省屬冬小麥產區，大部分小麥于4月上旬開始抽穗，此時病穗率為零，表明新穗不帶病原菌。小麥從齊穗期至灌漿初期，尤其是盛花末期，是赤霉病菌最易侵染麥穗的時期。本研究結果表明，4月中旬開始出現病穗，隨后病穗率快速攀升，推測這些病穗是由4月份田間稻樁赤霉病子囊殼釋放的孢子侵染麥穗后產生的。捕獲結果顯示，3月份浙江省麥田空氣中赤霉病菌游動孢子數約是4月份和5月份的4倍，表明赤霉病菌子囊孢子主要在3月份釋放。3月份釋放的赤霉病菌孢子是否可侵染小麥或其他寄主而產生次生孢子，繼而在4-5月份參與侵染麥穗，尚不 清楚。

3.2 赤霉病菌種群的組成

國內外學者研究表明，不同地區小麥赤霉病菌的種群組成存在差異，國內菌株主要為和，其中為北方地區的優勢種，為南方地區的優勢種。氣溫和耕作制度(包括輪作方式)是影響小麥赤霉病菌種群組成的重要因素。陳鴻逵等從浙江省采集到的500個赤霉病穗樣品中，發現478個病穗可鑒定到，占比93.9%，不過樣品包括大麥和小麥的病穗；Gale等從浙江省4個地區采集的病穗種共分離到225個菌株，鑒定結果全部為；Qu等從分離到的437個赤霉病菌菌株中，發現57個采自浙江省的菌株被鑒定為；Zhang等在分離到的469個菌株中，發現有30個采自浙江，其中26個被鑒定為，4個被鑒定為。本研究結果表明，是浙江省3個地區(杭州市蕭山區、桐廬縣以及寧波市象山縣)赤霉病菌的優勢種。此結論與陳鴻逵等和Gale等的鑒定結論不一致，但與Qu等和Zhang等的鑒定結論一致。此觀點也與上述為中國南方地區優勢種這一規律相符。

3.3 赤霉病菌菌株對多菌靈的抗性頻率

目前殺菌藥劑仍是生產實踐中防治小麥赤霉病的重要武器，其中多菌靈已被長期廣泛使用，這已導致田間多菌靈抗性菌株的產生。周明國等于1992年在浙江省海寧市采集的405個小麥病穗上分離到1個抗性菌株，抗性頻率約為0.25%；次年在該市采集的802個小麥病穗上分離到10個抗性菌株，抗性頻率約為1.25%。本研究測定了從浙江麥田分離到的386個赤霉病菌菌株，結果發現有72個抗性菌株，抗性頻率為18.65%。此抗性頻率低于近期江蘇樣品的檢測結果(26.3%～54.5%)，但明顯高于近期湖北樣品的檢測結果(3%)；與1993年浙江省海寧市樣品的抗性頻率(1.25%)相比，已增長近14倍。

3.4 赤霉病菌菌株對4種殺菌藥劑的敏感性

鑒于浙江省赤霉菌株對多菌靈的抗性頻率已近二成，在生產上應減少多菌靈在小麥赤霉病防控中的應用，應選擇不含多菌靈的殺菌藥劑。為此本研究測試了目前市場主推的4種不含多菌靈的殺菌藥劑對浙江省赤霉病菌菌株的抑菌效果，結果表明，這4種藥劑的抑菌效果均良好。勞曉梅等和方志峰等應用40%戊唑·咪鮮胺水乳劑分別在浙江省嘉興市和海寧市麥田，翁俊雄應用30%唑醚·戊唑醇懸浮劑在浙江省紹興市麥田，均發現對防治小麥赤霉病有較好的抑菌效果，與本研究試驗得到的結論一致。

本研究還分析了殺菌藥劑兩兩混配對赤霉病菌菌株的抑菌效果，結果顯示，混配方案“75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑”+“30%唑醚·戊唑醇懸浮劑”的抑菌率最高。這兩種殺菌藥劑都含有戊唑醇，此外還分別含有肟菌酯和吡唑醚菌酯，肟菌酯和吡唑醚菌酯都是線粒體呼吸鏈抑制劑，推測這兩種殺菌藥劑可通過抑制細胞呼吸來抑制真菌生長。