嗜烴乳化菌SL-1與內源菌協同驅油的菌群作用關系研究

李彩風，王曉，李崗建，林軍章，汪衛東，束青林，曹嫣鑌，肖盟

（1 中國石化勝利油田分公司石油工程技術研究院，山東 東營 257000； 2 青島科技大學化工學院，山東 青島 266042；3 中國石化勝利油田分公司，山東 東營 257001）

引 言

我國稠油油藏具有分布廣且儲量豐富的特點，由于稠油中膠質、瀝青質含量高，限制了稠油在儲層中的流動，開采難度大[1]。微生物驅油技術主要是利用微生物的生長代謝活動來提高原油采收率，具有低碳、環保、低成本、可持續的特點。微生物代謝過程中可產生表面活性物質，降低原油黏度。因此，利用微生物提高稠油油藏采收率具有良好的發展前景。嗜烴乳化菌既具有烴降解性能，同時又可利用激活劑或石油烴產生表面活性劑或乳化劑實現原油的乳化，因此，該類微生物在采油過程中發揮著重要作用。但由于油藏中微生物物種組成復雜，其生長代謝受環境因素影響較大，對油藏中具有乳化功能的內源微生物的定向調控存在較大難度。與內源微生物相比，外源菌可控性較強，且具有復雜度低、穩定性好的特點[2]。因此，向油藏注入外源嗜烴乳化功能菌，調控油藏微生物菌群結構，以最大限度激活油藏中的采油功能菌群，充分發揮菌群的驅油功能，已成為當今微生物采油技術發展的新方向[2]。

稠油微生物降黏的作用機理主要分為兩方面：一是微生物的降解作用使得稠油的平均分子量降低，二是微生物產生的表面活性劑或乳化劑能夠有效降低原油黏度。嗜烴乳化菌兼具降烴和乳化功能，如蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）[3]、地芽孢桿菌（Geobacillus）[4]、假單胞菌（Pseudomonas）[5]等，是重要的采油功能微生物。其中，地芽孢桿菌因其能夠耐受較高的油藏溫度，又具有可觀的乳化效果而備受關注。地芽孢桿菌通過產生大分子乳化劑實現原油的降黏[6]，部分地芽孢桿菌能夠選擇性地降解長鏈烷烴[7]。李國強等[8]分析發現地芽孢桿菌所產乳化劑具有耐高溫、耐鹽、耐酸堿的特性。宋永亭等[9]利用微觀可視模型，發現地芽孢桿菌可有效驅替盲端殘余油、柱狀殘余油和膜狀殘余油等多種類型的殘余油。此外，物模驅油實驗表明，地芽孢桿菌與內源菌群共培養可提高微生物數量，降低殘余油飽和度，強化驅油效果[2]。

目前，內-外源菌協同作用的研究已涉及物模實驗、現場實驗以及原油特征等方面。物模實驗表明地芽孢桿菌與內源菌群協同作用，能夠有效提高原油采收率。然而，稠油油藏環境下地芽孢桿菌與內源菌群間的協同作用機制尚不清晰，缺乏外源菌與內源菌群間的協同關系，以及外源菌對內源菌群結構及穩定性影響等方面的研究，導致對外源菌的調控作用缺乏理論依據，限制了內-外源菌協同驅油技術的應用。本研究利用勝利油田篩選出的一株地芽孢桿菌Geobacillus stearothermophilusSL-1 與稠油油藏內源菌群協同培養，考察內-外源菌協同作用下微生物對原油的降解及降黏特性，通過菌群結構分析，探討菌株SL-1與內源菌群的協同作用關系，以為菌株SL-1在現場的應用提供理論支撐。

1 實驗材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株來源 菌株Geobacillus stearothermophilusSL-1 由勝利油田石油工程技術研究院微生物采油研究中心提供，前期研究表明，該菌具有較好的乳化降黏特性，可在65～70℃范圍內生長繁殖[9-10]。

1.1.2 試劑及培養基 試劑：酵母粉、蛋白胨購自北京奧博星生物技術有限公司，乙酸乙酯、二氯甲烷、磷酸氫二鉀、氯化鈉等試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司，為市售分析純。

LB培養基：酵母粉5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，pH 7.0；營養激活劑：葡萄糖0.3%，蛋白胨0.3%，酵母粉0.2%，磷酸氫二鉀0.27%，氯化鈉0.5%，pH 7.0，用模擬地層水配制；原油及水樣取自勝利油田某稠油油藏，原油初始黏度為1023.9 mPa·s，將過濾后的注入水和產出液按1∶1（體積比）混合作為模擬地層水。

1.1.3 儀器 pH 計（PHS-3E），上海儀電科學儀器股份有限公司；空氣浴恒溫振蕩器（HZQ-C），哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；氣質連用儀（Agilent 6890/5975），美國安捷倫科技有限公司；紫外-可見光分光光度計（752 型），上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 實驗的設置及運行

向模擬地層水中加入營養激活劑，分裝至滅菌后的500 ml玻璃瓶中，原油添加量為50 g/L;用LB 培養基在65℃、150 r/min 下振蕩培養菌株SL-1 至對數生長期（48 h）；取活化后的菌液，離心洗滌后，以等體積PBS 緩沖液重懸菌體，然后按10%接種量向模擬地層水中加入菌株SL-1，用丁基橡膠塞封口，于65℃恒溫培養箱中靜置培養，以模擬地層厭氧環境，實驗運行期間每天搖勻樣品兩次，并以不加營養激活劑或菌株SL-1 的樣品作為對照，具體實驗設置如表1所示。每隔5 d進行一次地層水及營養的更替，營養更替前，采用注射器收集瓶中所產氣體，測定所產氣體體積后轉移至氣體采樣袋中。采用氣相色譜（Bruker 50-GC,Bruker,USA）對菌群所產氣體進行測定。首先繪制H2、CO2、O2、N2和輕烴的標準曲線，然后采用外標法對所測氣體進行定量及歸一化。氣體H2、CO2、O2、N2色譜條件為：采用TCD 檢測器，進樣口溫度150℃，檢測器溫度175℃，柱箱初溫50℃，保留11 min，以8℃/min的速率升溫至190℃，共計28.5 min。小分子烴色譜條件為：采用FID 檢測器，進樣口溫度310℃，檢測器溫度320℃。柱箱升溫條件：35℃保留15 min，以2℃/min 的速率升到300℃，保留10 min，共計117.5 min。色譜柱為HP-1毛細管色譜柱。

表1 樣品組成情況Table 1 Composition of each sample

1.3 原油黏度、正構烷烴組成分析

將降解后的原油經離心后，置于65℃烘箱中干燥24 h，采用哈克流變儀（HAAKE MARS, Thermo,Germany）測定65℃原油黏度[11]。采用柱色譜方法分離原油四組分[12]，采用氣相色譜-質譜聯用儀（Thermo Finnigan Trace-DSQ, Thermo, Germany）測定原油中正構烷烴組成[13]。采用HP-5毛細管色譜柱，色譜條件為：50℃保持1 min，以20℃/min升溫至120℃，然后以4℃/min 升溫至250℃，最后以3℃/min 升溫至300℃，保持30 min。載氣為氦氣，流速為1 ml/min。

1.4 微生物群落結構分析

離心獲得菌群細胞，于-80℃的條件下保存。菌群基因組DNA 按照Soil DNA Kit（Omega，美國）的步驟提取，提取后經PCR擴增細菌16S rRNA的V3-V4區，正 向 引 物 為341F (5′-CCTACACGACGCTCT TCCGATCT-NCCTACGGGNGGCWGCAG-3′)，反 向引 物 為805R (5′-GACTGGAGTTCCTTGG-CACCCG AGAATTCCAGAC-TACHVGGGTATCTAATCC-3′ )[14]，擴增產物經純化后，送至深圳華大基因進行高通量測序并完成微生物群落結構的分析工作。選取豐度前10的物種作為關鍵物種，計算關鍵物種間的Spearman 相關系數，構建關鍵物種的相關性網絡圖（相關系數閾值＞0.5，P＜0.01）。

2 實驗結果與討論

2.1 產氣量及產氣組成

由圖1 可知，A、B 組由于未添加營養激活劑，僅產生極少量氣體。C、D 組添加營養激活劑后，經過30 d 的培養，累積產氣量分別為117 和277 ml，且以添加嗜烴乳化菌SL-1 的產氣量最高。對C、D 組所產氣體進行氣相色譜分析，氣體組成如表2所示。兩組中所產氣體主要為CO2和CH4。D組中CH4含量顯著高于C 組，表明添加菌株SL-1 不僅有助于提高菌群的產氣量，而且能夠顯著提高CH4的含量。

圖1 不同營養及菌群組合方式下累積產氣量Fig.1 Cumulative gas production under different nutrition and flora combinations

表2 氣體組成分析Table 2 Analysis of gas composition

2.2 原油黏度及正構烷烴含量變化

原油黏度變化如圖2所示。本文所用原油屬稠油，初始黏度為1023.9 mPa·s，經菌群作用后，A 組原油黏度降至988 mPa·s，表明在不添加營養激活劑和外源菌的條件下，僅依靠內源菌無法實現原油的有效降黏；B 組經菌株SL-1+內源菌作用后原油黏度降至671.4 mPa·s，降黏率為34.4%，表明在不添加激活劑條件下菌株SL-1 的加入對原油黏度的降低起到一定的促進作用。在添加營養激活劑條件下，C 組和D 組原油黏度分別降至554.8 和209.8 mPa·s，降黏率分別為45.8%和79.5%，表明有機營養添加后，微生物對原油的降黏作用顯著提高，且D 組添加菌株SL-1后具有最高的降黏率。將C 組和D 組作用后原油進行四組分分離，對正構烷烴做GC-MS 分析，結果如圖3 所示。對于正構烷烴，D 組中部分中低碳數正構烷烴（C14～C17）的相對含量略高于C 組，但高碳數正構烷烴（C18～C35）的含量低于C 組，表明添加嗜烴乳化菌SL-1后能夠選擇性強化高碳數正構烷烴的降解。高碳數正構烷烴的含量是決定原油黏度的重要因素，因此，該類烷烴的降解有利于原油黏度的降低。

圖2 原油黏度變化Fig.2 Changes of crude oil viscosity

圖3 不同樣品中正構烷烴相對含量Fig.3 Relative content of n-alkanes in different samples

2.3 菌群物種組成

經7 輪次地層水的更替和營養注入后，對A、B、C、D 組中細菌進行高通量測序分析，編號分別為A_7、B_7、C_7、D_7。其中，Alpha 多樣性分析見表3。Shannon 指數和Simpson 指數反映了微生物群落多樣性的高低，Shannon 指數越大，Simpson 指數越小，表明菌群物種多樣性越高。而Chao1 指數越大，代表物種豐富度越高。對于Shannon 指數和Chao1 指數，A、B組高于C、D組，Simpson指數恰恰相反，由此可見，激活劑加入后微生物群落的多樣性有所降低。添加激活劑后原油黏度降低明顯，因此對C、D 組做門水平物種組成柱狀圖（圖4）。物種豐度在所有樣品均低于0.5%的物種和該分類水平未注釋到的全部合并成Others。C、D 兩組厚壁菌門（Firmicutes）、熱孢菌門（Thermotogae）相對豐度較高。其中，厚壁菌門的豐度在C 組激活過程中呈現出先減小后增大的趨勢，而在D 組的中后期厚壁菌門、熱孢菌門的豐度較為穩定。

圖4 激活過程中門水平物種組成柱狀圖Fig.4 Species composition at phylum level during stimulation process

表3 Alpha多樣性分析Table 3 Alpha diversity analysis

經過7 輪次的營養更替后，對A、B、C、D 四組樣品在屬水平做聚類熱圖分析（圖5）。由圖5 可知，A_7、B_7 兩組未添加營養激活劑，且二者未聚類在同一分支，表明菌株SL-1 的加入能夠改變內源菌群的結構。A 組中高溫脫硫弧菌屬（Thermodesulfovibrio）、Pseudothermotoga、Caldanaerovirga、Thermomicrobium、嗜氫菌屬（Hydrogenophilus）相對豐度明顯高于其他組。 高溫脫硫弧菌屬（Thermodesulfovibrio）是一類能夠在50～70℃條件下生長，以H2為電子供體，以硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽為最終電子受體生長繁殖的硫酸鹽還原菌[15]，且在烷烴的厭氧降解過程中與產甲烷菌呈現出互營關系，進而推動甲烷的產生[16]。Pseudothermotoga屬熱袍菌目，可代謝產生乙酸、丙酸等揮發性脂肪酸[17]。Thermomicrobium起初發現于熱泉中，能夠產生乙醇脫氫酶[18]，該酶最適溫度為70℃，且在較高溫度下仍具有較好的穩定性[19]。由此可見，內源菌群中存在大量嗜高溫采油功能菌，且具有不同的生態學功能。添加菌株SL-1 后Pusillimonas、Gemmobacter、Rhodobacter、Thermoanaerobacter、Thiofaba、Salinihabitans相對豐度明顯高于其他組，Desulfomicrobium、Rhizobium、Tistrella、Legionella也有較高的相對豐度。其中，Pusillimonas能夠降解大部分的正構烷烴（C5～C30），但該類微生物不能降解芳烴類物質[20]。Gemmobacter是一種以亞硝酸鹽為電子受體的甲烷氧化菌。高溫厭氧桿菌屬（Thermoanaerobacter）可產生鼠李糖脂生物表面活性劑[21]，同時，又可通過發酵淀粉、木糖等底物產氫[22]。Thiofaba是一類無機自養型硫氧化菌，該類菌廣泛存在于高溫油藏中[23]。因此，在未添加有機營養條件下，菌株SL-1的加入能夠使得油藏中的部分微生物相對豐度升高，主要集中在烷烴降解菌和產表面活性劑菌。

圖5 屬水平聚類熱圖Fig.5 Clustering heatmap at genus level

添加營養激活劑后，內源菌群結構再次發生變化。聚類結果顯示，C_7 組和D_7 組聚類在同一分支，表面菌群的同源性較高。C_7 組中Caldanaerobacter相對豐度明顯高于其他組，該菌常與氫營養型產甲烷菌呈互營關系[24]。Gelria和Moorella也有較高豐度，二者在厭氧烴降解過程中呈互營關系[25]。D_7 組中引入了嗜烴乳化菌SL-1，Geobacillus、Atribacteria、Thermotoga相對豐度明顯高于其他組，尤其是Geobacillus在四組中相對豐度最高，表明在添加營養激活劑條件下，嗜烴乳化菌Geobacillus stearothermophilusSL-1 能夠定植于內源菌群中且占有較高豐度。在厭氧條件下，Atribacteria可通過發酵短鏈正構烷烴產生脂肪酸來獲得能量[26]。Thermotoga是一類嚴格厭氧菌，在油藏環境中可通過發酵烴類化合物產生H2[27]。此外，在C_7 組 和D_7 組 中，Rhodothermus、Ciceribacter、Oceanibaculum、Helicobacter、Desulfomicrobium、Rhizobium、Tistrella、Legionella均具有較高豐度。Ciceribacter為硝酸鹽還原菌，通過對硫代硫酸鹽的氧化實現硝酸鹽 的 還 原[28]。Oceanibaculum和Desulfomicrobium為烴 降 解 菌[29-30]，且Desulfomicrobium對 長 鏈 烷 烴（C17～C30）表現出較強的降解性能[31]。Rhizobium和Legionella可降解多環芳烴[32]，其中，Rhizobium可通過產生胞外多糖促進烴類物質的降解[33]。Tistrella本身不具有降解多環芳烴的性能，但可強化其他微生物對多環芳烴的降解[34]。因此，營養激活劑的加入，能夠顯著激活菌群中的嗜烴乳化菌和烴降解菌，尤其是芳烴降解菌尤為顯著。菌群引入嗜烴乳化菌Geobacillus stearothermophilusSL-1 后，產氫菌Thermotoga豐度的增加預示著可為氫營養型產甲烷菌提供充足的底物，而D 組具有最高的甲烷含量（表2），推斷產甲烷菌被有效激活。而菌株SL-1 在內源菌群中穩定存在，也使得原油黏度進一步降低（圖2）。

2.4 樣品間多樣性分析

采用主成分分析法（principal component analysis, PCA）對C、D 兩組各樣品不同激活階段的菌群間親緣關系進行分析（圖6）。C_1～C_7 為內源菌群樣品，由于各點較為分散且距離相對較遠，表明激活過程中C 組各樣品菌群結構差異性較大，未能達到穩定狀態。D_1～D_7 為內-外源菌群協同培養的樣品，D_1 和D_2 距離較遠，表明在菌株SL-1接入內源菌群的初期，菌群差異性較大，樣品D_3～D_7 距離較為接近，即該5 組樣品的群落組成較為相似，表明隨著激活時間的推移，菌群結構逐漸穩定且相似性增加。由此推斷，菌株SL-1的加入有利于內源菌群結構的穩定，穩定的菌群結構有助于烴降解菌、產酸菌等采油功能微生物代謝性能的穩定發揮，因此，D 組中長鏈烷烴顯著降解，所產氣體中甲烷含量增加，原油黏度顯著下降。

圖6 激活過程中各組樣品的主成分分析Fig.6 Principal component analysis of samples during stimulation

2.5 物種相關性分析

采用Cytoscape 軟件繪制可視化網絡圖。節點的大小代表物種豐度大小，紅色連線表示正相關，藍色連線表示負相關，線條的粗細表示Spearman 相關系數大小，即物種間相關性的大小。菌群物種相互關系如圖7 所示。Geobacillus與Pseudothermotoga elfii、Coprothermobacter proteolyticus、Gelria glutamica、Rhodobacter maris、Thermohydrogenium kirishiense呈 正相關性，這些微生物在D 組中均具有較高豐度（圖5）。其中，Pseudothermotoga elfii常見于厭氧過程中，可將原油轉化為H2，且在表面活性劑的作用下，H2產量可提高12 倍[27]。Coprothermobacter可通過蛋白水解作用產生乙酸、H2、CO2[35]，Coprothermobacter proteolyticus與Methanothermobacter thermautotrophicus共培養過程中，H2和CH4的產量均顯著升高[36]。Gelria是一類乙酸氧化菌，與氫營養型產甲烷菌呈互營關系[37]。由此可見，Geobacillus主要與產酸菌及產氫菌呈正相關性，這也使得D 組H2含量高于C 組（表2），而這些微生物常與氫營養型產甲烷菌呈互營關系，產氣中甲烷含量的增加也預示著產甲烷菌的激活。綜合以上分析，營養激活劑能夠顯著激活內源菌群中的烴降解菌，嗜烴乳化菌Geobacillus stearothermophilusSL-1 的加入降低了原油黏度，進一步促進了烴降解菌對原油的降解，為體系中Pseudothermotoga、Coprothermobacter、Thermotoga、Gelria、Rhodobacter等產氫微生物提供了充足的底物，使得這些微生物物種豐度增加，其代謝產物又有利于氫營養型產甲烷菌的生長代謝，CH4含量的增多表明產甲烷菌代謝活性增強，預示著整個功能菌群代謝鏈的激活。

圖7 內-外源菌協同作用下物種間相關性分析Fig.7 Correlation analysis among species under the synergisticefficacy of indigenous and exogenous bacteria

3 結 論

本文分析了嗜烴乳化菌GeobacillusstearothermophilusSL-1 與內源菌協同作用前后原油的黏度變化、烴降解情況，以及菌群的結構變化，闡述了菌株SL-1 與內源菌群間的相互作用關系，主要結論如下。

（1）激活劑能夠激活內源菌群中的硝酸鹽還原菌、烷烴降解菌和芳烴降解菌，在此基礎上，菌株SL-1 的加入使得Atribacteria、Thermotoga等烴降解菌的豐度升高。

（2）菌株SL-1與Pseudothermotoga、Coprothermobacter、Gelria、Thermotoga等產氫細菌呈正相關性。這些產氫菌豐度的增加，使得所產氣體中H2含量升高，為氫營養型產甲烷菌提供充足的底物，從而推動氫營養型產甲烷菌的激活，CH4含量增多。

（3）菌株SL-1能夠在內源菌群中穩定存在且增強菌群結構的穩定性，與內源菌群的協同作用，不僅有利于原油的乳化降黏及長鏈烷烴的降解，還進一步激活了油藏中的產氫菌和產甲烷菌，實現了整個功能微生物代謝鏈的激活。