HPLC-MS/MS法同時測定難治性癲癇患者血漿中托吡酯、左乙拉西坦和卡馬西平的濃度

李超 王建欣 朱秀芳

難治性癲癇約占癲癇病例的10%，具有治療困難，病情易反復等特點[1]。治療仍以藥物治療為主，托吡酯、左乙拉西坦(LEV)與卡馬西平(CBZ)的聯合治療顯示出明顯的療效，減少了癲癇發作頻率并具有良好的安全性，通常是難治性癲癇一個有用的臨床選擇[2]。然而，這些抗癲癇藥物的使用具有患者個體差異大、安全性低和毒性高等特點。因此，監測藥物的血藥濃度是臨床實踐中調整劑量、減少不良反應和確保療效的一個重要指示。本研究在現有研究的基礎上[3-14]，建立了一種基于HPLC-MS/MS的方法，用于快速、準確地測定難治性癲癇患者中托吡酯、左乙拉西坦和卡馬西平的濃度。

1 材料與方法

1.1 儀器 美國AB SCIEX公司電噴霧離子源(ESI源)4000Q TRAP型質譜儀)；含液相輸液泵、自動進樣器和日本日本島津公司的HPLC-30A液相色譜系統；美國SCILOGEX公司D3024型臺式高速微量離心機。

1.2 實驗藥品與試劑 托吡酯、左乙拉西坦及卡馬西平對照品，均由成都德斯特生物技術有限公司提供，含量均≥98%，批號分別為：DST181230-023、DST190223-028和DST190228-318；；內標咖啡因內標，購自中國食品藥品檢定研究院，含量：99.9%，批號：171215-2010。空白血漿取自河北醫科大學第一醫院。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件：色譜柱為Phenomenex Kinetex XB-C18，(2.6 μm，50×3 mm)；流動相為甲醇(A)-水(含2%的甲酸)(B)，按照以下梯度進行洗脫(0～2 min，30∶70→80∶20；2～4 min，80∶20；4～5 min，80∶20→30∶70)；流速為0.4 ml/min；柱溫為40℃；進樣量為5 μl。

1.3.2 質譜條件：ESI源，正離子模式進行檢測，MRM模式進行掃描；ESI源電壓為5 500 V，ESI源溫度為 600℃；氣簾氣壓力為20 psi，輔助氣壓力為55 psi，霧化氣壓力為55 psi，碰撞氣壓力為High；毛細管入口和出口的電壓都為10 V。見表1。

表1 托吡酯、左乙拉西坦、卡馬西平和咖啡因的質譜碎片及參數

1.3.3 對照品和內標溶液配制

1.3.3.1 對照品溶液配制：精密稱定托吡酯對照品5.00 mg，用甲醇定容為1 mg/ml的托吡酯儲備液。甲醇稀釋該托吡酯儲備液成濃度分別為5、50、150 μg/ml的托吡酯系列質控樣品以及濃度分別為1、5、10、50、100、150、200 μg/ml的托吡酯系列標準曲線溶液；以上述同法配置濃度分別為50、200、500 μg/ml和濃度分別為0、50、100、200、300、500、700 μg/ml的左乙拉西坦系列質控樣品和系列標準曲線溶液；濃度為5、50、150 μg/ml和濃度分別為1、5、10、50、100、150、200 μg/ml的卡馬西平系列質控樣品和標準曲線溶液。

1.3.3.2 內標溶液配制：精密稱定咖啡因對照品1.00 mg，用甲醇將對照品定容為1 mg/ml的咖啡因內標儲備液。后用甲醇將其稀釋成1 μg/ml的咖啡因內標溶液。

1.3.4 血漿樣品處理：在100 μl空白血漿中加入10 μl 內標溶液及30 μl甲醇，渦旋混勻30 s后，加入260 μl甲醇，再渦旋混勻60 s，以12 000 r/min于室溫下離心10 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，續濾液取5 μl進樣分析。

1.3.5 方法學考察

1.3.5.1 專屬性：以給藥60 min后患者血漿、對照標準品+空白血漿和空白血漿的各6個樣品分別進樣，測定各樣品的色譜圖。

1.3.5.2 標準曲線及定量下限：在100 μl空白血漿中分別加入10 μl不同濃度的托吡酯、左乙拉西坦、卡馬西平系列標準曲線以及內標溶液，配成濃度為0.1、0.5、1、5、10、15、20 μg/ml的托吡酯系列血漿樣品，1、5、10、20、30、50、70 μg/ml的左乙拉西坦系列血漿樣品， 0.1、0.5、1、5、10、15、20 μg/ml的卡馬西平系列血漿樣品，以1/χ2為權重，將y/x進行進行回歸分析，其中y=待測物峰面積/內標峰面積，x為待測物的濃度。

1.3.5.3 準確度及精密度：于100 μl空白血漿中，分別加入10 μl不同濃度的托吡酯、左乙拉西坦、卡馬西平系列質控樣品溶液以及內標溶液質控樣品溶液，配成濃度為0.5、5、15 μg/ml托吡酯，5、20、50 μg/ml左乙拉西坦，0.5、5、15 μg/ml卡馬西平的系列血漿質控樣品溶液各6份，連續3 d進行測定，并計算其準確度、日內精密度和日間精密度。

1.3.5.4 提取回收率及基質效應：取不同濃度分別為0.5、5、15 μg/ml的托吡酯，濃度為5、20、50 μg/ml左乙拉西坦，濃度為0.5、5、15 μg/ml卡馬西平的血漿質控樣品溶液各6份，得峰面積A；另取100 μl 的空白血漿18份，均加入260 μl甲醇，渦旋混勻60 s， 12 000 r/min室溫下離心10 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，將相應濃度的托吡酯、左乙拉西坦、卡馬西平和咖啡因溶液加入續濾液中，渦旋60 s后進樣分析，得峰面積B。提取回收率=峰面積A/峰面積B。以100 μl空白血漿100 μl，得空白基質，加入10 μl不同濃度的托吡酯、左乙拉西坦、卡馬西平質控樣品溶液以及內標溶液，配成濃度為0.5、5、15 μg/ml托吡酯基質考察樣品，5、20、50 μg/ml左乙拉西坦基質考察樣品，0.5、5、15 μg/ml卡馬西平的基質考察樣品各6份，進樣分析，得相應峰面積C；于純水中加入不同濃度的托吡酯、左乙拉西坦、卡馬西平質控樣品及內標溶液質控樣品，配成濃度分別為0.5、5、15 μg/ml托吡酯質控樣品，5、20、50 μg/ml左乙拉西坦質控樣品， 0.5、5、15 μg/ml卡馬西平的質控樣品各6份，得相應峰面積D。內標歸一化的基質因子=峰面積C/峰面積D×100%。

1.3.5.5 穩定性：取24份血漿質控樣品溶液，分別含濃度分為0.5、5、15 μg/ml托吡酯，5、20、50 μg/ml左乙拉西坦，0.5、5、15 μg/ml卡馬西平，考察其在室溫6 h放置、處理后3 d放置、3次反復凍融、20 d-20℃凍存的穩定性。

1.3.6 臨床應用

1.3.6.1 受試者的選擇：本研究方案已經過河北醫科大學第一醫院倫理委員會的審查和批準。納入標準：所有納入的患者均符合《神經外科與癲癇》中難治性癲癇的診斷標準[1]；患者正在繼續接受托吡酯、左乙拉西坦和卡馬西平的口服治療；左乙拉西坦維持劑量為30 mg·kg-1·d-1；托吡酯維持劑量為4 mg·kg-1·d-1；卡馬西平維持劑量為15～20 mg·kg-1·d-1；已獲得患者和家屬的知情同意；并且未同時聯用其他抗癲癇藥物；排除標準：非癲癇性精神疾病的患者；孕婦和哺乳期女性；嚴重肝腎功能損害患者；易過敏體質者，對托吡酯、左乙拉西坦和卡馬西平存在禁忌證者。

1.3.6.2 受試者血樣采集：這些受試者按維持劑量口服3種藥物1 d以上達穩態濃度。在早晨用藥前0.5 h取前外側靜脈中抽取5 ml血液，于肝素鈉管中，以5 000 r/min離心10 min，取上層血漿并儲存在-80℃的冰箱中以備測量。

2 結果

2.1 專屬性 根據以上操作得到托吡酯、左乙拉西坦、卡馬西平和咖啡因的保留時間分別為2.81、0.88、3.38 和1.19。其中內源性物質不會對托吡酯、左乙拉西坦、卡馬西平和咖啡因的測定結果產生影響，有良好的專屬性。見圖1。

圖1 托吡酯(Ⅰ)、左乙拉西坦(Ⅱ)、卡馬西平(Ⅲ)和咖啡因(Ⅳ)的色譜圖；A 空白血漿；B 空白血漿+托吡酯+左乙拉西坦+卡馬西平+內標；C 血漿樣品+內標

2.2 標準曲線及定量下限 托吡酯的標準曲線方程為Y=261X152(r=0.9638)，在0.1～20 μg/ml線性范圍內具有較好的線性關系，定量下限為0.01 μg/ml；左乙拉西坦的標準曲線方程為y=2.36×103x+3.57×104(r=0.9959)，在1～70 μg/ml線性范圍內具有較好的線性關系，定量下限為0.1 μg/ml；卡馬西平的標準曲線方程為y=2.31×104x+2.55×104(r=0.9215)，在0.1～20 μg/ml線性范圍內具有較好的線性關系，定量下限為0.01 μg/ml。

2.3 準確度與精密度 3種藥物的準確度均在±15%范圍內，日內和日間精密度的標準偏差均在15%以下，符合生物樣品定量分析的要求[15]。見表2。

表2 血漿中托吡酯、左乙拉西坦和卡馬西平的準確度和精密度 n=6

2.4 提取和基質效應 測得在3個濃度的托吡酯、左乙拉西坦和卡馬西平回收率分別為為91.68%～106.45%、103.52%～107.24%和93.57%～104.31%，其內標歸一化的基質因子分別為92.52%～103.87%(RSD<15%，n=6)、91.79%～104.25%(RSD<15%，n=6)和94.23%～104.48%(RSD<15%，n=6)；咖啡因回收率為92.34%，內標歸一化的基質因子為98.61%(RSD<15%)。該提取物相關參數符合生物樣品定量的相關要求[15]，且樣品測量不受基質的影響。見表3。

表3 血漿中托吡酯、左乙拉西坦和卡馬西平的提取回收率和基質效應 n=6

2.5 穩定性 血漿樣品溶液在室溫6 h放置、處理后3 d放置、3次反復凍融、20 d -20℃凍存的條件下均穩定，RSD值均小于15%。見表4。

表4 血漿中托吡酯、左乙拉西坦和卡馬西平的穩定性 n=6

2.6 臨床應用 共納入32例難治性癲癇患者，其中男14例，女18例；年齡20～48歲，平均(34.6±7.65)歲；體重45～67 kg平均(54.0±6.02)kg；身高172～180 cm,平均(175.3±2.29)cm。經測定32例難治性癲癇患者體內托吡酯血藥濃度為3.34～12.56 mg/ml，平均(7.92±1.82)μg/ml；左乙拉西坦的血藥濃度為15.62～48.25 kg/ml，平均(30.34±8.13)μg/ml；卡馬西平的血藥濃度為3.24～15.29 mg/ml，平均(7.74±2.44)μg/ml。

3 討論

目前測定血漿中托吡酯、左乙拉西坦和卡馬西平濃度的方法有傳統的HPLC法及HPLC-MS/MS法。傳統的HPLC法靈敏度相對較低、專屬性較差，而單一成分的檢測方法效率不高，不適用于臨床大樣本的血藥濃度監測。在這項研究中，開發了一種HPLC-MS/MS方法，可以同時測量血漿中3種藥物的濃度，從而減少分析時間，提高分析方法的靈敏度和特異性。本研究將甲醇作為蛋白沉淀劑，在血漿樣品處理上，與液-液萃取法相比，本法提取回收率較高，此外甲醇沉淀法更經濟環保、便于操作。

本研究結果顯示，32例難治性癲癇患者臨床常規劑量給予托吡酯、左乙拉西坦和卡馬西平達穩態時，測得托吡酯血藥濃度為3.34～12.56 μg/ml，與其臨床推薦血藥濃度5～20 μg/ml相比[16,17]，有2例患者低于該濃度范圍；測得左乙拉西坦血藥濃度為15.62～48.25 μg/ml，與其臨床推薦有效血藥濃度12～46 μg/ml相比[18,19]，有1例患者高于該濃度范圍；測得卡馬西平血藥濃度為3.24～15.29 μg/ml，與其臨床推薦有效血藥濃度4～12 μg/ml相比[20,21]，有1例患者高于該濃度范圍，1例患者低于該濃度范圍。由此得出這3種藥物在不同人群中血藥濃度差別大，存在一定的個體差異性。臨床使用時需進行TDM監測，以便制定個體化給藥方案，減少不良反應的發生。

綜上所述，本研究建立的同時測定血漿中托吡酯、左乙拉西坦和卡馬西平濃度的HPLC-MS/MS法，適用于臨床上監測難治性癲癇患者體內的血藥濃度，從而用于指導患者調整給藥方案，提高用藥的合理性，減少不良反應的發生。