近視視網膜病變與CaMKKβ/AMPK信號通路的相關性

龍丹寧 莫亞 何希 郭傳恒 馬捷

近視是一種多因素疾病，其特征是平行光聚焦在視網膜前方，而不是聚焦在放松眼睛的視網膜上。在視覺通路中，視網膜是第一個檢測光信號并將光信號轉化為神經元信號的地方。近視視網膜病變作為近視的主要并發癥之一，其對視功能有一定的危害，甚至引起失明，會帶來極大的經濟負擔、社會壓力和心理壓力。目前雖然對近視視網膜致病機制通路方面的研究頗多，例如前列腺素F2α-FP受體信號通路[1]、miRNA- mRNA信號通路[2]、多巴胺受體D1信號通路[3]等，但是對于自噬在近視視網膜病變研究方面尚未見報道，CaMKKβ/AMPK信號通路作為新的研究熱點及經典通路，已有研究表明二者存在相關性，且自噬和氧化應激均與視網膜病變高度相關，故本文將主要從這方面來闡述表達，旨在為近視視網膜病變提供新的研究和治療方向。

1 近視與視網膜病變

1.1 近視總體概要 近視是全球范圍內一種常見的眼病，近年來屈光不正尤其是近視的患病率在急劇上升,且呈低齡化趨勢[4]。2000年全球有近14億人近視，據估計，到2050年此數字將高達48億，高度近視患病率占10億，且未矯正的近視將會是全球遠距離視力障礙的主要原因[5]。近視進一步發展導致的高度近視眼底病變會出現脈絡膜視網膜萎縮、視網膜脫離、后鞏膜葡萄腫、視網膜撕裂及視網膜變薄等并發癥，可致不可逆的視力損害，甚至引起失明，且研究表明大多數不可逆的失明是由視網膜疾病引起的[6]。筆者發現目前尚不清楚近視確切的發病機制。多數研究認為近視是由環境和遺傳風險因素共同引起的[7]，迄今為止發現的所有遺傳位點都表明屈光發育是由許多重疊的生物學過程介導的異質過程，因此不可能由一個基因(或基因家族)單獨負責視網膜萎縮或新生血管病變的發展[8]，有一些環境風險因素例如競爭性和壓力性教育系統[9]，睡眠時間變短，戶外活動時間減少及長時間觀看電子產品等也參與近視的形成過程。已有研究表明控制近視進展可以使近視視網膜疾病的相對風險降低約3倍[10]，因此，在近視的進展過程中需要采取有效策略來延緩近視的發生發展并預防并發癥的出現，以避免視功能障礙，進一步影響生活質量。

1.2 近視的視網膜病變

1.2.1 視網膜厚度：視網膜位于眼球壁的內層，為一層柔軟而透明的膜，其是由色素上皮層和視網膜感覺層組成。視網膜有包含感知圖像焦點的機制，可在屈光發育過程中產生調節眼睛生長的信號。屈光狀態的改變將伴隨眼軸長度的改變，在組織學上，眼軸的變長會導致視網膜的生物力學伸展，進而引起視網膜變薄[11]，影響視網膜細胞的供血和供氧[12]。近視程度與視網膜厚度顯著相關，隨著近視程度的增加，小凹旁和小凹周圍區域的視網膜厚度將會迅速減小[13]，主要與赤道和赤道前區域的視網膜厚度變薄有關，中央凹區域受影響較小，水平軸和垂直軸的視網膜厚度的也是不對稱的[14]。有研究表明近視兒童的中心凹旁視網膜厚度平均變薄6 μm，然而在18個月內，視網膜厚度和各層的縱向變化幅度很小(18個月內平均變化< 2 μm)，且在12歲時的顳側視網膜厚度變薄與隨后1年內的眼軸增長有強烈的相關性，在性別上男孩的眼軸長度增加較女孩多[15]。在高度近視眼中黃斑部的個體視網膜厚度與眼軸<26 mm的眼睛年齡呈負相關，主要是在內層視網膜、光感受器和總視網膜中，可能原因為衰老與視網膜神經元和神經膠質細胞損傷有關[16]。

1.2.2 視網膜氧供：視網膜是一個需氧量高、新陳代謝強、氧化還原反應活躍的組織。在生理條件下，視網膜不斷受到外界光線的刺激，引起光氧化作用，促進氧自由基的形成。此外，細胞內的有效抗氧化劑，如超氧化物歧化酶是可以及時清除氧自由基的。氧氣主要通過兩種方式組合傳遞到視網膜，包括脈絡膜血管床和視網膜脈管系統。視網膜作為主要的耗氧組織之一，而且還作為人體中氧化環境最明顯的組織之一，在光感受器內節盤膜和內部叢狀層的區域中視網膜最容易發生缺氧[17]。隨著近視程度的加深，黃斑區淺表和深層視網膜血管密度降低[18]，血管的異常會改變氧氣的供應，自由基超氧化物或過氧亞硝酸鹽的產生會損害視網膜導致視網膜萎縮、視網膜脫離等的出現，因為眼睛血管化為視網膜提供了較高的局部氧氣壓力。視網膜中的氧化應激還會引起視網膜色素上皮層細胞變性和感光細胞的丟失[19]，視網膜的退行性病變又促進近視形成和發展。

1.2.3 視網膜血管：視網膜是中樞神經系統的一部分，具有大腦特有的新陳代謝，且眼部的代謝水平遠遠高于腦組織，視網膜的高能量需求通常與大量代謝物匹配，當視網膜血流受損時視網膜神經元有興奮性毒性細胞死亡的風險[20]。視網膜微血管網絡維持眼內環境穩態，可直接為視網膜組織提供氧氣和營養，近視性血管損傷致使穩態失衡而會引起細胞變性壞死，導致近視視網膜疾病甚至喪失視功能。脈絡膜作為眼睛的血管層可間接為外層視網膜提供氧氣和營養。近視導致眼軸延長會機械拉伸視網膜組織，并隨著軸向伸長方向使視盤傾斜，從而導致視網膜中央凹旁微血管密度減少[21]，視網膜小動脈血氧飽和度降低，中央凹無血管區面積增大，且深層視網膜血管密度減少與視網膜平均光敏感度、最佳矯正視力的降低密切相關。此外，視盤傾斜程度與乳頭周及深小凹旁血管密度和中央凹無血管區面積呈正相關。同時伴隨近視的進展，眼軸延長使視網膜厚度變薄會導致視網膜血管內皮細胞和視網膜色素上皮細胞變性，從而引起血管內皮生長因子產生和微血管密度的相應降低[22]，在高度近視眼中會出現淺表血管密度降低，視網膜外流量增加[23]，而視網膜微血管血流速度保持不變。視網膜微血管網絡的改變可能歸因于隨著近視進展而發生的眼軸延長，對視網膜微血管系統的新定量分析可能有助于表征近視的潛在病理生理學，并能夠及早發現和預防近視性視網膜病變[24]。

1.2.4 視網膜微生態:視網膜色素上皮是高度特化的單層色素細胞，在神經視網膜和血管脈絡膜之間形成屏障，在維持視網膜穩態方面起著非常重要的作用。視網膜作為感光組織，可檢測和處理視覺圖像[25]，它是通過感測光并產生脈沖來實現此目的，然后通過視神經將其傳輸到大腦[26]。視網膜細胞可在屈光發育過程中產生調節眼睛生長的信號，其中散焦圖像對視網膜神經節細胞的信號傳導影響顯著，例如可降低視神經中峰值的頻率。在近視患者中發現多焦視網膜電圖反應密度下降，這種改變主要是由于視網膜感受器功能受損所致[27]。線粒體功能障礙可改變有氧能量代謝，與許多視網膜疾病有關，其中包括感光細胞變性[28]。Ca2+在視桿和視錐感光細胞的功能和存活中起重要作用，因此保持適當的Ca2+穩態對光感受器的健康和生存至關重要[29]。血清 25-羥基維生素 D與近視發展及眼部炎癥呈負相關趨勢，維生素 D 可在Ca2+調節功能中起作用，例如抗氧化或抗炎。體內和體外的既往研究均表明，近視發生過程中視網膜色素上皮組織形態學和離子穩態發生變化，且視網膜色素上皮分泌的多巴胺、乙酰膽堿等神經遞質和轉化生長-β、肝細胞生長因子和胰島素樣生長因子等多種生長因子與近視發展過程密切相關[30]。與室內光線相比，室外陽光有更強烈的短波輻射，視網膜多巴胺水平會隨著短波光的反應而增加，視網膜電路中的紫外線錐體可能是短波光保護的基礎[31]。Yang等[32]研究發現近視進展與葡萄糖含量增加和脂質生物合成減少之間呈負相關，在近視進展過程中檢測到大部分已知的氨基酸，發現酪氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸均是減少的。

2 CaMKKβ/AMPK信號通路在近視視網膜病變中的運用

2.1 CaMKKβ/AMPK信號通路 AMP激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是由一個催化α亞基和兩個調節亞基β和γ組成的異構復合物[33]，不同組合可創建12個不同的AMPK復合物。α亞基包含激酶結構域和關鍵殘基Thr172，該殘基被上游激酶磷酸化。β亞基包含碳水化合物結合模塊，該模塊允許AMPK與糖原結合。γ亞基使AMPK能夠響應ATP與AMP比率的變化，因為它包含四個串聯腺嘌呤核苷酸β-合酶結構域，并與腺嘌呤核苷酸結合。Ca2+是二級信使，在細胞信號傳導中起重要作用，鈣調蛋白(Calmodulin,CaM)是一種較小的蛋白質[34]，CaMKKβ為CaMKK的一種亞型，是被細胞內鈣水平升高激活的主要激酶。

AMPK是能量穩態的中央調節器[35]，被提議用來調節能量穩態[36]，細胞生長，自噬和線粒體生物學[37]。作為細胞能量傳感器，AMPK具有兩種激活模式，可以通過細胞本身或通過AMPK介導的上游酶激活[38]。上游AMPK激酶CaMKKβ可以在響應細胞Ca2+增加的情況下激活AMPK[39]，而不需要ATP/ADP/AMP水平的任何顯著變化[40]，AMPK的最獨特的核苷酸非依賴性調節是CAMKKβ將Thr172磷酸化[41]。

CaMKKβ/AMPK信號通路是調節細胞能量代謝的經典途徑之一[42]。AMPK不僅是氧化還原信號的傳感器，而且一旦被激活也起著抗氧化的作用[43]，氧化應激已被認為是導致近視發生的潛在機制[44]，近期也有研究首次提出近視、氧化應激以及生長因子3個因素可在近視患者中共存。

2.2 自噬與CaMKKβ/AMPK信號通路 自噬是一種基本的分解代謝機制，可維持細胞內穩態，最早由De Duve[45]于1963年提出在巨噬細胞自噬過程中，噬菌體的成核和膨脹導致自噬體形成，隨后自噬體成熟，與溶酶體融合，產生自溶酶體[46]，它降解異常或受損的蛋白質和細胞器[47]，最終的分解產物，例如氨基酸，核苷，碳水化合物和脂肪酸，為生物合成和能量產生提供了底物，從而維持了細胞的新陳代謝[48]。自噬主要可以分為三種類型：宏觀自噬，伴侶介導的自噬和微自噬。

自噬水平在生理條件下較低，但在低氧條件下可增加，這種增加可以加重傷害，但也可以起到保護作用。自噬在免疫系統中有多個角色，例如調節炎癥，參與微生物的降解等[49]。活化的AMPK調節各種代謝過程，包括自噬，還可以上調線粒體的自噬降解(有絲分裂)，因為它可以誘導網絡中受損的線粒體破碎，并促進自噬機制向受損的線粒體移位[50]。1993年Gordon等第一次報告了Ca2+對自噬的調節[51]，自噬與細胞內Ca2+調節相關，對細胞內或細胞外Ca2+離子的去除可抑制自噬。最近的研究證明Ca2+可通過CaMKKβ激活AMPK，進一步抑制mTOR并激活自噬，CAMKKβ抑制劑可有效阻斷AMPK活性和自噬通量，從而降低細胞活力[52]。自噬的有效控制對于開發針對缺氧性損傷的新治療策略至關重要[53]。

2.3 CaMKKβ/AMPK信號通路在近視視網膜病變中的應用 由于近視而引起的視網膜病變通常會導致視力障礙，其潛在的分子機制在很大程度上尚不清楚[54]。直到最近，研究才專注于自噬在視覺系統中的作用。自噬的經典過程可以概括為5個步驟：起始/成核，延伸，成熟，融合和降解[55]。眼睛，尤其是視網膜，暴露于各種環境損害和壓力下，包括基因突變和與年齡有關的變化，這些都會導致功能障礙[56]。近視視網膜疾病中，自噬起著雙重作用：促進視網膜細胞的存活和死亡。正常水平的自噬有助于視網膜細胞防御有害壓力。但是，自噬過多會導致視網膜退化[57]及視網膜毛細血管周細胞死亡。在近視小鼠研究中發現視網膜神經生長因子相關受體的表達增加，其與視網膜神經細胞凋亡密切相關。同時在形覺剝奪性近視形成過程中發現視網膜色素上皮層細胞中的Ca2+濃度增高，進一步激活CaMKKβ/AMPK信號通路而誘發自噬。

線粒體的選擇性自噬，稱為線粒體吞噬，是重要的線粒體質量控制機制[58]，許多視網膜病變，例如糖尿病性視網膜病變中繼發性視錐細胞感光細胞死亡，都與線粒體功能障礙直接或間接相關[59]，同時相關的動物實驗證明在近視小鼠視網膜微血管內皮細胞中，自噬可通過CaMKKβ/AMPK信號通路在缺氧狀態下被激活，從而起到對視網膜的調控作用。在近視視網膜疾病形成過程中炎性因子也參與疾病進展，例如白介素-6、腫瘤壞死因子-α、核因子kB等，CaMKKβ/AMPK可在炎性因子的刺激下被激活起到抗炎作用，多種作用協同可對近視視網膜疾病起到調控作用。

3 近視視網膜疾病分子細胞機制及信號通路探索

3.1 近視視網膜疾病的探索

3.1.1 近視的治療現狀：近視目前全球高患病率及低齡化趨勢，已成為青少年的首要眼病，同時已有研究證實在近視進展過程中大多數不可逆的失明是由視網膜疾病引起的，例如引起的眼底并發癥脈絡膜視網膜萎縮、視網膜變薄、視網膜脫離、視網膜劈裂等，其中視網膜的內層劈裂多發生在神經纖維層和神經節細胞層，由內部牽拉引起(即玻璃體、內界膜牽引及視網膜血管微褶皺牽拉引起)，外層視網膜劈裂多發生在外叢狀層和外顆粒層(主要由外部牽拉，即后鞏膜葡萄腫)[60]。雖然近視引起的視覺模糊癥狀通過光學方式可以矯正，但近視問題不僅僅在于光學方面，還在于眼部的病理改變。目前對于近視的治療已提出多種方法干預，例如生活方式干預、藥理干預、光學策略及屈光手術治療等多種方法，但在肯定治療效果的前提下也出現了不可避免的并發癥，例如使用不同濃度的阿托品滴眼液會引起畏光、視力模糊以及停藥后近視反彈等的并發癥，屈光手術會產生一過性或永久性眩光或光暈，尤其是夜間視力下降等。因此為進一步改善近視的致病及發展途徑，開始從潛在分子/細胞機制探索。

3.1.2 近視視網膜疾病的分子細胞機制探索：視網膜作為眼部耗氧和易發生氧化應激組織之一，對維持眼部穩態起著至關重要的作用。視網膜任何血管異常都會改變氧氣供應并可能導致暫時性缺氧。視網膜中的氧化應激會引發一系列并發癥，包括色素上皮層和光感受器的功能喪失，嚴重影響視力，并在近視視網膜形成過程中，色素上皮層的Ca2+濃度會增高，Ca2+的增加過多會引起視網膜光感受器細胞的變性。視網膜毛細血管網絡直接為視網膜組織提供氧氣和營養，這可能促使視網膜更容易受到近視相關改變的影響，同時Yuan等[61]研究發現輕度眼內炎癥近視性視網膜病變的發生和發展中也起重要作用。此外，在晶狀體誘發近視和形式剝奪性近視治療后，視網膜中許多基因的表達水平也發生了變化。已有動物實驗研究證實在近視早期豚鼠視網膜有顯著的脂質代謝異常[62]。通常，每個視網膜可以檢測到 1 000 多個蛋白質點。其中 32 個在近視和未治療的視網膜之間顯示出差異表達，例如β-肌動蛋白、烯醇化酶 1、胞質蘋果酸脫氫酶等[63]。視網膜連接蛋白35/36的功能調節對于近視視網膜中的視覺信號傳遞過程至關重要，在近視視網膜蛋白質點很多受Ca2+的影響，進一步激活CaMKKβ/AMPK信號通路引起自噬，對近視視網膜疾病起到調節作用。

3.2 近視視網膜疾病與CaMKKβ和 AMPK信號通路

3.2.1 自噬與Ca2+信號：自噬作為一種生理細胞過程，可在細胞內進行溶酶體介導的自我消化和再循環來維持穩態，例如在近視視網膜缺氧或暴露于分子等細胞壓力條件下，自噬機制可被激活。自噬也可影響免疫反應的幾個關鍵組成部分，因此在調節近視視網膜炎性反應中起著關鍵作用。Ca2+作為機體各項生理活動不可缺少的離子，可對自噬起到雙向調節作用。在過去的十年中，Ca2+信號在自噬調節中的作用引起了很多爭議。盡管各種信號信使和下游通路都參與自噬調節，但最近Ca2+已被認為是不同細胞類型中這一過程的重要參與者。自噬正常進行所需的Ca2+信號可以源自特定的細胞內來源(高爾基體、溶酶體或其他酸性囊泡等)或通過不同的Ca2+通道來自細胞外介質，如激活下游效應器，Ca2+與CaMKKβ/AMKP 信號通路相關[64]。Ca2+可(維生素 D3、毒胡蘿卜素等)通過涉及 CaMKKβ和 AMPK 的信號通路抑制 MTOR 的活性，從而誘導自噬體積累。此外Ca2+信號傳導也可以獨立于Ca2+介導的 AMPK 激活誘導自噬[65]。Ca2+通道作為離子通道的一種，控制自噬發生的機制在于可介導離子流入/流出細胞或細胞器，控制跨細胞膜的電位差，另一個機制是可調節脂質從細胞內細胞器和質膜到吞噬細胞組裝位點的轉移。

3.2.2 CaMKKβ/AMPK信號通路的激活： AMPK 是關鍵的細胞能量傳感器和代謝穩態調節器。通常AMPK 有兩種激活模式，可以被細胞本身激活，也可以被 AMPK 介導的上游酶激活。在其上游蛋白質中， CaMKKβ是一種重要的上游活化酶，與細胞代謝有關。而CaMKKβ/AMPK信號通路是調節細胞能量代謝的經典通路之一。激活的AMPK上調分解代謝途徑并下調合成代謝途徑以促進外周組織中ATP的生成。在細胞應激期間ATP與 AMP 的比率下降，該蛋白激酶就會被激活。AMPK 激活會下調消耗能量的途徑，例如蛋白質合成，同時上調產生 ATP 的途徑，例如脂肪酸氧化。既往對AMPK活性基因的研究表明在 CaMKKβ 下游激活的 AMPK 存在于細胞質和細胞質中。CaMKKβ是一種重要的Ca2+通道激酶，Green等[66]研究表明CaMKKβ/AMPK 復合物存在于靜息細胞的細胞質中以及在 Ca2+刺激之后，在Ca2+刺激后 AMPK 的激活首先發生在細胞質中，然后再在細胞核中激活。Ca2+可提高細胞溶質鈣濃度，通過激活CaMKKβ/AMPK途徑引起自噬，此外淀粉樣蛋白β也通過相同的 CaMKKβ/AMPK 信號通路促進自噬囊泡的形成。可對近視的視網膜病變進行預防及治療，同時，對近視進展過程中的氧化應激、眼部炎癥、疼痛等也有一定的改善作用。

總之，近視會引起眼部相應的視網膜病變，例如視網膜變薄，視網膜萎縮等，既往研究已經證明氧化應激和自噬與近視視網膜疾病密切相關，在視網膜發育的生理過程中會消耗大量的氧氣，近視導致視網膜生物力學的拉伸會進一步增加耗氧量，并且在近視形成過程中，視網膜色素上皮細胞中Ca2+濃度增高[67]，上游AMPK激酶CaMKKβ可以在響應細胞Ca2+增加的情況下激活AMPK，從而調節能量穩態、細胞生長、自噬和線粒體生物學，進一步應對近視視網膜損傷，防止近視視網膜病變。