細胞焦亡介導呼吸系統感染性疾病的研究進展

楊治安 何瑤 劉維英 余勤

在我們過往熟知的細胞死亡方式中，根據死亡細胞的形態特征、死亡原因以及是否受機體調控，將死亡方式分為細胞自噬、細胞壞死、細胞凋亡、壞死性凋亡以及細胞鐵死亡等。近年來，細胞焦亡成為研究的熱點，它是一種新的與炎性反應相伴隨的程序性壞死樣細胞死亡方式，在清除外源性病原體感染和內源性危險信號損傷中發揮重要作用，但由于它無法準確識別“自己”與“異己”成分，所以焦亡也會破壞正常細胞，造成機體部分功能障礙。細胞焦亡在呼吸系統疾病的發生發展過程中扮演重要角色，本文就細胞焦亡介導幾種主要的呼吸系統感染性疾病的研究現狀做如下綜述。

1 細胞焦亡概述

1.1 細胞焦亡的發現歷程：關于細胞焦亡的最早認識，可以追溯到1986年，Friedlander[1]發現用炭疽致命毒素處理小鼠巨噬細胞，導致細胞內容物快速外釋引起細胞死亡。之后很長時間由于受限于當時實驗條件而未能準確描述記錄其特征，以至于被錯誤歸類為細胞凋亡[2]。1999年發現了Caspase-1依賴性細胞死亡[3]，為日后奠定Caspase-1在焦亡中的核心地位提供了重要遺傳證據。直至2001年Cooksen等[4]提出了pyroptosis一詞，將這種依賴Caspase-1的特殊的快速死亡方式，命名為細胞焦亡。2002年，Martinon等[5]提出炎性小體作為Caspase-1活化平臺，能夠調節Caspase-1的活化。后期隨著gasdermin蛋白家族的發現，細胞焦亡途徑變得相對完整。

1.2 細胞焦亡的特征與功能 由于炎性反應的出現和Caspase-1的活化，細胞焦亡被當作一種非典型性細胞死亡方式，同時具備細胞凋亡及細胞壞死的部分相關特征[6]。焦亡的免疫防御功能主要是通過破壞病原體復制點位以及通過胞膜成孔特性進而裂解細胞直接殺死胞內細菌來實現[7]。見表1。

表1 細胞焦亡、細胞凋亡、細胞壞死的異同點

1.3 細胞焦亡的通路蛋白

1.3.1 模式識別受體與NLRP3：炎癥小體固有免疫系統感受外來病原體侵襲及機體內部損傷分子主要依靠模式識別受體(pattern-recognition receptor,PRR)來完成[8]。根據PRR的亞細胞定位不同，可將其分為胞膜上受體和胞質內受體2組，筆者發現NLR受體(NOD-like receptor)是目前研究較為廣泛的胞質內受體，該蛋白家族中目前研究最多的當屬NLRP3。在細胞焦亡中，NLRP3通過PYD結構域與接頭分子含胱天蛋白酶募集結構域凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC)通過同型相互作用而結合，繼而結合Caspase-1前體，即pro-Caspase-1，激活Caspase-1[9]。我們將NLRP3-ASC-pro-Caspase-1復合體稱之為NLRP3炎癥小體。

1.3.2 Caspase蛋白酶Caspase-1和 Caspase-4/5/11：Caspase蛋白酶全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase)，它是一組以酶原形式存在于胞質中的具有相似結構的蛋白酶家族，在細胞程序性死亡過程中發揮重要作用。目前，在哺乳動物細胞中被鑒定出的caspase家族成員有16 種，人類細胞中被鑒定出的有11種，其中Caspase-1是該家族中第1個被證實具有將pro-IL-1β、pro-IL-18分別激活為IL-1β、IL-18特性的成員，因此Caspase-1也被稱之為interkeukin 1b conberting enzyme(ICE)，即白介素轉化酶[10]，參與細胞焦亡經典途徑；Caspase-3被證實與細胞凋亡相關；Caspase-4/5/11則參與細胞焦亡非經典途徑。

1.3.3 gasdermin蛋白家族：人類gasdermin蛋白家族包括GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME以及DFNB59六種，其中GSDMD又稱為消皮素D，是細胞焦亡經典途徑和非經典途徑的共同效應分子[11]，是細胞焦亡的直接執行者，通過寡聚化在細胞膜上打孔，故也將其形象稱之為“打孔蛋白”。GSDMA、B、C、E都具有類似于GSDMD的成孔特性，而DFNB59還未被證實。研究還發現，GSDMB在人類的多態性與幼兒早期哮喘關系密切[12]，DFNB59的遺傳突變會導致人類的非綜合征性聽力喪失[13]。

1.4 細胞焦亡的信號通路 人和小鼠體內的細胞，在發生焦亡時，根據所依賴的Caspase種類不同，可以將焦亡途徑分為以下兩類：經典途徑和非經典途徑。病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)或者危險相關分子模式(danger-associated molecular pattern,DAMP)作為初始刺激物，刺激啟動經典途徑；脂多糖(LPS)作為初始刺激物，啟動非經典途徑。見圖1。

圖1 肺組織巨噬細胞焦亡經典途徑和非經典途徑信號傳導模式圖

2 細胞焦亡與呼吸系統感染性疾病的關系

細胞焦亡過程必須在機體嚴密精細的調控之下進行，一旦調節失衡，會導致組織損傷和破壞，亦或機體代謝紊亂、功能缺失與亢進等。肺臟是一種特殊的器官，擁有敏感的氣道上皮-血管內皮細胞交界面，以便在暴露于病原體和氣溶膠毒素等應激源中時，依舊能夠進行通暢且高效的氣體交換。

2.1 細菌性肺炎與病毒性肺炎 在細菌性肺炎中，當革蘭陰性菌侵入肺組織細胞后，受到其胞壁成分脂多糖(LPS)或胞質內脂多糖的刺激，細胞焦亡非經典途徑被激活，人的caspase-4/5和小鼠的caspase-11作為胞內受體[14-16]，通過CARD結構域直接識別LPS，然后寡聚形成的多蛋白復合物，直接激活GSDMD，介導焦亡進程，所以caspase-4/5/11在非經典途徑中同時扮演了PRR和焦亡誘導劑的角色；當然在此過程中也可以間接激活caspase-1，進入焦亡經典途徑，實現兩條途徑的融合；革蘭氏陽性菌則通過誘導NLRP3炎癥小體形成，激活更為常見的焦亡經典途徑引起肺組織炎性反應，信號傳導通路如圖1所示。對于病毒性肺炎，有研究證實甲型流感病毒通過識別呼吸道上皮細胞的維甲酸誘導基因-I(RIG-I)受體，誘導細胞發生焦亡，引起炎性反應[17]。2003年SARS冠狀病毒(SARS-CoV)與2019年新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的急性呼吸綜合征，通過大量的臨床取樣研究，發現患者血清中IL-1β、乳酸脫氫酶(LDH)等促炎因子含量明顯增加[18]，進而招募白細胞、單核細胞來源的巨噬細胞聚集，可顯著加重肺炎癥狀，包括嚴重的呼吸窘迫和發熱，我們將其稱之為細胞因子風暴，也稱為細胞因子釋放綜合征，與疾病的加重有關[19]。SARS-CoV至少表達3種激活NLRP3炎癥小體的蛋白質：胞膜、ORF3a和ORF8b，通過改變胞內外離子濃度、線粒體損傷、ROS生成增加等機制激活NLRP3炎癥小體，誘導焦亡發生[20]。鑒于SARS-CoV-2與SARS-CoV的遺傳相似性約79%， SARS-CoV-2也可同樣激活NLRP3炎癥體；此外SARS-CoV-2病原體相關的分子模式也可被RNA感知模式識別受體識別，包括TLR3、TLR7、TLR8以及位于細胞質中的RIG-I[21]。由于吞噬病毒的巨噬細胞發生焦亡導致細胞破裂釋放大量的胞內容物，包括病毒顆粒、細胞因子、趨化因子、LDH、ATP和ROS等，促使周圍免疫細胞接力這種炎性反應，從而誘導焦亡鏈式反應，我們也將此稱之為細胞焦亡的“級聯放大效應”，因此廣泛的焦亡可能在短時間內引起組織過度損傷、器官衰竭、甚至是機體的死亡。有研究發現，在COVID-19肺炎患者中，由于焦亡誘導的炎性反應，還可以出現凝血功能異常[22]、川崎病[23]等并發癥。治療方面，無論是細菌性肺炎，還是病毒性肺炎，用NLRP3抑制劑可以顯著降低此類并發癥的發病率，而通過抑制NLRP3的另一個潛在好處是可以改善肺炎患者的共患病病情，以慢性疾病常見，包括高血壓、慢性阻塞性肺疾病、2型糖尿病和心血管疾病等，新冠肺炎患者病死率在老年人群體中較高，所以運用NLRP3抑制劑可以有效降低重癥肺炎患者或肺炎合并多種慢性基礎疾病患者構成比，同時降低病死率; 也有研究發現，阻斷NLRP6以增加中性粒細胞相關的細菌清除應被視為治療金黃色葡萄球菌肺炎的潛在治療干預策略[24]；在不破壞炎癥小體激活的情況下阻止GSDMD孔形成也是一種很有前途的治療切入點，因為人們可以通過引起炎癥性細胞凋亡死亡而不是焦亡來限制細胞內的病毒復制和擴散，從而限制廣泛的組織炎癥播散。

2.2 慢性阻塞性肺病(COPD)體外細胞實驗表明，支氣管上皮細胞株，暴露在煙霧刺激中，可以出現caspase-1介導的細胞焦亡[25]。Yang等[26]研究發現，相比于正常小鼠，NLRP3基因敲除小鼠對于煙霧刺激的耐受性更高，同時肺功能下降也不明顯。可吸入顆粒(particulate matter)也是COPD的致病因素之一，其暴露于氣道會誘導上皮細胞內NLRP3炎癥小體活化。Li等[27]發現NLRP3/caspase-1信號通路在PM2.5顆粒誘導的肺損傷和肺部炎癥中是必需的，而通過caspase-1抑制劑(Z-YVAD-FMK)干預可以顯著減輕肺損傷，此發現可能為今后顆粒物呼吸毒性的研究提供思路。研究發現，COPD患者氣道中的炎性小體激活物，包括ROS、細胞外ATP和其他DAMP有所增加[28]，而在肺泡灌洗液、血液或者痰液中，IL-1β、IL-18等細胞焦亡的下游因子明顯增加[29]。IL-1β是炎癥放大的啟動因子，能募集、激活其他免疫細胞，誘導趨化因子(如IL-18)、炎性因子(如IL-6)、黏附分子等的合成，Fu等[30]發現COPD患者氣道中IL-1β的表達水平和全身炎癥范圍、急性加重頻率存在相關性，提示IL-1β可作為該病風險預測因子指導臨床。肺組織中的IL-18高表達會引起肺氣腫，而IL-18含量會隨著COPD病情加重而增加，所以血清中IL-18含量與肺功能指標呈負相關，基于此我們可以通過檢測血清中IL-18含量來作為COPD穩定期病情嚴重程度評估的指標[31]。Udjus等[32]研究表明，Caspase-1 通路的激活可以導致肺血管平滑肌增殖，引起肺動脈高壓。綜上，細胞焦亡在COPD氣道上皮損傷和肺氣腫的形成過程中發揮了重要作用，而且炎性因子的長期釋放與氣道慢性長期損傷存在緊密的聯系，當然也為臨床COPD患者管理提供了診斷、治療、監測的新靶點。

2.3 支氣管哮喘 氣道上皮完整性的喪失是哮喘發病機制的重要標志，細胞死亡作為氣道上皮完整性缺失的機制之一，得到了大家的廣泛關注。無論是在輔助性T淋巴細胞2(Th2)相關性哮喘還是非Th2相關性哮喘，無論是體外過敏原攜帶的PAMP，亦或者是機體內部致敏小分子攜帶的DAMP，NLRP3炎癥小體均可被激活，如前文所述GSDMB與哮喘關系密切，GSDMB蛋白被Caspase-1切割，釋放其N末端片段，在細胞膜上形成空洞，誘發細胞焦亡。Tsai等[33]研究發現，粉塵螨變應原Der F1可以誘導以Caspase-1活化和IL-1β分泌為特征的炎癥體形成，通過焦亡經典途徑引起上皮細胞死亡，破壞氣道上皮完整性。動物實驗表明，哮喘小鼠體內NLRP3炎癥小體和Caspase-1蛋白表達增加，下游炎性因子，諸如IL-1β、TNF-α明顯增加[34]。疾病治療方面研究發現，利用Caspase-1抑制劑預處理上皮細胞，或者通過Si-RNA轉染沉默NLRP3，可以減少IL-1β等促炎因子的釋放，或者剪接變異體rs11078928通過刪除編碼GSDMB N末端13個氨基酸的外顯子6，從而使GSDMB喪失誘發焦亡的能力[35]，以達到治療的目的。目前臨床中，運用糖皮質激素只能起到緩解哮喘患者癥狀的作用，同時還面臨部分患者糖皮質激素耐受、甚至抵抗的嚴峻形勢下，在此背景下尋找一新的治療靶點意義深遠。前列腺素E2(PGE2)常表現出多種促炎活性被大家所熟知，但矛盾的是，PGE2亦通過抑制干擾素-β(IFN-β)的產生，減弱STAT-1的磷酸化，抑制焦亡進程，有助于炎癥的控制和消退，恢復內環境穩態，從而對哮喘和過敏性氣道炎癥起到一定的保護作用[36]。

2.4 急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)/急性肺損傷(ALI) ARDS/ALI是一種頑固性、進行性低氧性呼吸衰竭，以急性彌漫性肺泡損傷、中性粒細胞大量涌入和肺泡腔富含蛋白質的滲出物為特征，因高死亡率備受關注，而無節制的肺部炎癥可能是高死亡率的原因。既往研究發現巨噬細胞在其發病機制中起關鍵作用，體內實驗表明，LPS暴露下的肺組織，中性粒細胞、巨噬細胞大量浸潤，Caspase-1裂解增加，IL-1β分泌活躍[37]；而體外細胞實驗也驗證了這一結論，LPS處理巨噬細胞后，NLRP3和Caspase-1表達明顯上調[37]。因此，各種病因不僅通過增加巨噬細胞和中性粒細胞的募集引起過度的肺部炎癥，還可以通過巨噬細胞的焦亡引起促炎性因子的大量釋放，所以推測細胞焦亡可能是ARDS/ALI肺部過度炎癥的重要發病機制之一。P38-MAPK信號通路可能參與ARDS/ALI的炎性反應[38]，炎癥相關因子的產生，包括IL-1β、TNF-α、IL-6等，都是通過P38-MAPK信號通路，這也為炎性反應的調控提供了作用靶點。當阻斷肺泡巨噬細胞中P38-MAPK信號通路時，NLRP3的表達、Caspase-1的裂解明顯減低，IL-1β等細胞因子的表達也減少，而凋亡相關蛋白表達、Caspase-3的裂解則出現明顯增加，這一現象提示阻斷P38-MAPK信號通路可能促使巨噬細胞死亡方式由焦亡向凋亡的轉變，細胞凋亡可以阻斷促炎介質、蛋白酶、活性氧的產生和溶菌酶的滲漏，進而保證機體擁有一定限度的損傷耐受性[39,40]，所以細胞死亡方式的這一轉變可能是為通過阻斷P38-MAPK信號通路而控制ARDS/ALI肺部炎癥提供了治療的理論依據。

作為機體天然免疫的重要組成部分，焦亡在有效清除病原體入侵及體內危險分子損害方面發揮重要作用，但是由于其級聯放大的炎性反應特征，IL-1β、IL-18等不同程度地參與了呼吸系統感染性疾病的發生發展。因此，也可以將細胞焦亡的過程稱之為炎癥發生的過程，焦亡的程度在一定意義上反映了炎癥的嚴重程度，二者相互關聯。在未來的實驗室研究以及臨床應用中，能否運用焦亡通路上下游各種信號分子作為疾病預防、病情監測、危險度分級、用藥評估、預后轉歸的參考依據，諸如通過化學法檢測血清中活性氧(ROS)成分含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量等來反應肺組織抗氧化能力，對疾病發展進行一定范圍內的預判；以及上文提到過的通過檢測炎性因子含量，對肺部感染輕重程度、全身炎癥范圍、急性加重頻率進行風險預測等。同時，相關研究也提出，GSDMD對于凋亡相關Caspase的敏感性較低，而將GSDMD位于C端與N端之間的區域進行剪切編輯以增加對凋亡通路相關蛋白的敏感性，這樣就可以進行凋亡過程的誘導，而后，人們又發現凋亡通路的關鍵蛋白caspase-3亦可以影響和激活GSDME，從而導致焦亡[41]，至此實現了凋亡與焦亡兩種不同細胞結局的雙向切換，從而抑制機體大范圍的炎性反應，成為疾病治療一個新的切入點，這些值得我們去進一步地思考和研究。

近年來，針對于細胞焦亡通路的靶向藥物研究也越來越多，特異性的NLRP3抑制劑、caspase-1抑制劑、IL-1抑制劑相對于傳統廣譜抗炎藥物，具有精準度高、安全性高的特點，但是目前真正應用于臨床的還比較少，所以希望未來越來越多此方面的藥物研究，能夠為患者帶來更多的治療選擇。