運動對SAMP8小鼠海馬tau蛋白磷酸化的影響

張慶茹 喬會敏 田惠杰 董梅 吳冰潔

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是發生在老年及老年前期，以進行性認知障礙和行為損害為特征的中樞神經系統退行性病變，嚴重影響老年人的生活質量。Tau蛋白異常過度磷酸化形成神經纖維纏結是AD常見的病理表現[1]。全世界約有1/3的AD患者可能因為某些可干預的危險因素而加劇病情，如糖尿病、高血壓、中年肥胖、低水平的身體活動、抑郁、吸煙和低文化水平等。適度的體育活動(如慢跑和步行)可以降低AD的發生率[1, 2]。快速老化P8小鼠(senescence-accelerated mouse/prone 8, SAMP8)是一種自然發病的AD模型。本研究組以往的研究發現，運動能夠改善SAMP8小鼠的學習和記憶能力[3]，延緩海馬神經元變性，降低海馬β淀粉樣蛋白及淀粉樣蛋白前體蛋白的表達[4],提高突觸素表達[5]。本實驗將通過研究跑籠運動對SAMP8小鼠海馬tau蛋白磷酸化的影響，以進一步完善運動改善SAMP8小鼠認知功能的病理學機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 SAMP8小鼠由香港中文大學解剖系姚大衛教授贈送。所有小鼠接受標準嚙齒類食物并自由進水。入選小鼠經過預選，有明顯缺陷(外部腫瘤、運動能力受限)的被剔除。雄性3月齡SAMP8小鼠20只。小鼠按隨機化原則進行分組，分為跑籠運動組和模型對照組，每組10只小鼠。另外，選取體重相匹配的雄性3月齡SAMR1小鼠10只作為正常對照組。

1.2 運動訓練方法 SAMP8跑籠運動組進行跑籠運動訓練。使用直徑15 cm、柵距1 cm圓形跑籠，小鼠放入跑籠內，自主運動開始后計時。第1個月：5 d/周，10 min/d；第2個月：5 d/周，20 min/d。SAMP8模型對照組及SAMR1正常對照組不接受跑籠運動。

1.3 免疫組織化學檢測 每組10只小鼠，采用4%水合氯醛麻醉(0.03 mg/g)，快速開胸暴露心臟，經左心室插管，剪開右心耳，灌注0.9氯化鈉溶液，待沖凈血液后，灌注4%多聚甲醛，斷頸取鼠腦，標本固定于4%多聚甲醛。24 h后將固定好的組織塊經脫水，透明、石蠟包埋備用。行6 μm厚連續冠狀切片，采用免疫組織化學SP法染色(具體操作步驟參照試劑盒說明書)。兔抗IgG多克隆抗體購于武漢三鷹生物公司，SP9001試劑盒及DAB顯色劑購于北京中衫生物技術有限公司。3,3’-二氨基聯苯(DAB)顯色，常規脫水、透明、封片。陰性對照用磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗，余步驟相同。于光學顯微鏡下觀察tau蛋白(T-tau)免疫組織化學陽性產物的分布，在相同的放大倍數下，每個標本計數3張切片，每個切片計數10個視野，采用廈門麥克奧迪儀器儀表有限公司生產Motic Med6.0數碼醫學圖像分析系統測定海馬CA1區免疫反應產物的光密度值，以陽性細胞染色的平均光密度值(OD)值來表示抗原表達量。

1.4 Western blot檢測 每組小鼠各稱取約20 mg海馬組織研磨，充分勻漿后按海馬：裂解混合液=1 mg ∶10 μl 加入裂解混合液，冰上裂解約1.5 h，每20 分鐘取出渦旋1次；低溫高速離心10 min(4℃、8 000 r/min)，取上清液分裝待測。在組織蛋白樣本管中按體積比=4∶1加入上樣緩沖液，混勻后在100℃沸水中水浴5 min。樣本蛋白經凝膠電泳分離后，將目的蛋白轉至PVDF膜。轉完膜后于 5%脫脂牛奶中封閉 2 h，洗膜后加入一抗[p-Tau(Ser396)抗體和β-actin 抗體稀釋比例均為1∶1 000]，4℃冰箱孵育過夜。次日洗膜后加二抗(抗體稀釋比例1∶10 000)，于37℃ 恒溫箱中孵育 60 min。洗膜后于蛋白印跡儀器中顯色拍照。分析蛋白條帶上各處理組 p-Tau(Ser396)和β-actin 蛋白的灰度值，p-Tau(Ser396)與β-actin 蛋白灰度值之比即為 p-Tau(Ser396)蛋白相對表達量。一抗購自拜奧德生物有限公司，二抗購自美國KPL公司。

2 結果

2.1 小鼠海馬CA1區形態改變 與SAMR1正常對照組比較，HE染色可見SAMP8模型對照組的小鼠海馬CA1區部分神經元細胞變性、死亡，細胞核濃縮，空泡變性；SAMP8跑籠運動組偶有神經元細胞變性、死亡，大部分細胞形態正常。見圖1。

圖1 小鼠海馬CA1區形態改變(HE染色×400)

2.2 海馬CA1區T-tau表達 免疫組化結果顯示3組間海馬CA1區T-tau免疫陽性反應產物的光密度值差異有統計學上意義(P<0.01)。組間兩兩比較，SAMP8跑籠運動組較SAMP8模型對照組光密度減低(P<0.01)；SAMR1正常對照組較跑籠運動組光密度減低(P<0.01)。見圖2，表1。

表1 海馬CA1區T-tau免疫反應產物的光密度值

圖2 小鼠海馬CA1區T-tau蛋白表達(×400)

2.3 海馬P-tau(Ser396)水平 Western blot 實驗結果顯示，3組間海馬p-Tau (Ser396)表達差異有統計學意義(F=97.976，P<0.01)。組間兩兩比較，SAMP8跑籠運動組較SAMP8模型對照組表達減低(P<0.01)；SAMR1正常對照組較跑籠運動組表達減低(P<0.01)。見表2，圖3。

圖3 海馬P-tau水平

表2 海馬P-tau水平

3 討論

快速老化小鼠是20世紀90年代京都大學武田公司從AKR/J小鼠中培育出來的一種快速衰老的小鼠株系。 其中SAMP8小鼠表現出衰老相關性神經特征，而月齡相匹配的SAMR1常被作為SAMP8的正常對照[6]。

本研究發現，跑籠運動可以延緩SAMP8小鼠海馬CA1區神經元的變性壞死并減少T-tau和P-tau的沉積。SAMP8跑籠運動組和SAMR1正常對照組相比較，結果顯示，跑籠運動未能使SAMP8小鼠海馬CA1區神經元細胞形態和tau沉積的改善達到正常同齡SAMR1小鼠水平。Jiang等[7]研究表明4個月的運動對年幼APP/PS1小鼠的空間學習能力和記憶能力有顯著的改善作用，同時延緩了海馬萎縮和神經元凋零。這與之前的本課題組有關SAMP8小鼠的系列研究的結論[3,4]一致。Chao等[8]也得出相似的結論，同時還表明運動可以減少AD樣小鼠的淀粉樣沉積，誘導神經發生，延緩神經元丟失，促進新生神經元的生存。

運動是預防或者延緩認知功能下降的一種非藥物性治療手段。運動可影響顱內血管生理功能、海馬體積和神經發生過程3個方面[9]，對認知功能產生正面改善作用。海馬組織與人類的情景記憶功能密切相關，這種功能在AD早期就出現明顯的損害。輕度至中度的超過1年的體育鍛煉可以防止海馬體積的萎縮[10]。SAMP8小鼠模型的特點是學習及記憶能力的顯著下降，同時也可以伴隨皮膚老化、心臟功能衰退、情緒焦慮和聽力障礙等癥狀，SAMP8小鼠在AD研究應用中發揮著重要作用[11]。3月齡SAMP8小鼠的腦組織病理的大腦皮質、紋狀體和海馬中就開始出現tau蛋白過度磷酸化[12]，4月齡的時候就有認知障礙的表現[13]。

Tau蛋白是一種微管相關蛋白，對維持神經元的功能和結構完整性起著重要的作用；同時它也參與軸突運輸和微管聚合等神經生理過程。但是細胞內過度磷酸化或者異常磷酸化的tau聚集會形成病理性tau。在AD的病理結構中，過度磷酸化的tau蛋白會首先沉積于嗅內皮層和海馬，然后才發展至腦內新皮質區域[14]。目前在國內外的動物實驗中，關于跑籠運動對AD模型小鼠tau影響的相關文獻還是比較少的。Liu等[15]對APP/PS1轉基因AD小鼠給予5個月的跑籠運動干預，結果顯示長期的跑步運動可以延緩tau的過度磷酸化，阻止AD的神經病理學進展。關于運動對AD tau過度磷酸化的影響機制，目前的文獻研究中尚不明確，而且不同的研究結果之間還存在爭議。Liu等[15]的動物實驗提供一些研究證據，表明tau蛋白激酶GSK3是運動和tau過度磷酸化之間的中介物質。但是Gratuze等[16]認為跑籠運動對動物的tau蛋白激酶沒有影響，如GSK3、CDK5、JNK和CamKII等激酶。有關此方面的機制，尚還需要未來大量的實驗觀點來完善。

總而言之，給予SAMP8小鼠2個月的跑籠運動干預，能改善tau蛋白在海馬CA1區的積聚，還可以延緩海馬神經元變性，能抑制tau的過度磷酸化。雖然這種改善不足以使SAMP8的tau蛋白沉積和神經元變性達到正常小鼠的病理水平，但是運動干預在SAMP的病理上還是有顯著積極影響的。