強直性脊柱炎患者血清IL-35、IL-17的臨床意義

王月明 田軍艷

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)患者是一種慢性炎癥性自身免疫性病癥，以外周大關節、椎旁軟組織、軸骨關節等為主要病變部位，疾病進展可出現關節強直、脊柱畸形[1，2]。現階段，我國AS患者約有400多萬，這一病癥具備的慢性進展性、致殘性等特點不僅會給患者帶來巨大的痛苦，還會造成社會重大經濟損失[2]。目前，AS發生機制尚未完全明確，主要與免疫、環境、遺傳等因素相互作用有關，且遺傳危險因素主要有TBX21、IL-27、PTGER4、NKX2-1、IL-12B、IL-7R、IL-6R、IL-1R2、IL-1R1等，這些因素多與經固有與適應性免疫效應細胞介導的白介素-17(IL-17)免疫有關。一部分研究顯示，AS發生多與免疫功能異常有關，特別是CD4+T細胞亞群，AS發生發展過程中調節性T細胞(Treg)/輔助性T細胞17(Th17)細胞亞群比例失調發揮著重要作用[3，4]。IL-17作為一種特異性細胞因子，多由Th17細胞分泌，可對白細胞活化、遷移產生促進作用，其在腫瘤、自身免疫性病癥發生發展中起著重要作用[5]。IL-35作為一種抑制性細胞因子，是IL-12家族中最新發現的一種細胞因子，其與IL-12家族細胞因子的結構特點相同，經IL-27β鏈Ebi3、IL-12α鏈p35組合而成，多由Treg分泌，其可對IL-17分泌、Th17細胞分化產生抑制，并促使Treg細胞增殖，進而參與集體免疫調節[6]。部分研究顯示，變應性鼻炎、系統性紅斑狼瘡及炎癥性腸病等免疫介導性病癥發生發展中IL-35有著重要作用[7-9]。本研究以AS患者為研究對象，分析血清IL-17、IL-35水平檢測對AS患者的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用回顧性分析方法，以2020年1月至2021年1月入院的62例AS患者為研究對象，設為研究組；以同期入院進行體檢的62例健康者為對照組。研究組中，男53例，女9例；年齡15～49歲，平均(32.06±7.82)歲。對照組中，男50例，女12例；年齡16～50歲，平均(32.39±7.94)歲。所有研究對象對本研究知情并簽署同意書，且本研究經醫學倫理委員會批準，倫理標號202001018。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①符合美國風濕病協會制定的AS診斷標準[10]；②無生物制劑、抗風濕藥及激素等治療；③資料完整。

1.2.2 排除標準：①哺乳期或妊娠期女性；②急慢性感染；③伴血液系統病癥；④伴其他免疫相關性病癥；⑤伴精神病癥。

1.3 方法

1.3.1 檢驗試劑、儀器：①試劑：Hs-CRP試劑盒(德國羅氏公司)、ELISA試劑盒(eBioscience公司)、HLA-B27試劑盒(BD公司)。②儀器：羅氏702全自動生化儀(德國羅氏公司)、Well Scan K3酶標儀(芬蘭雷勃公司)、SYM-BIO2510 酶標板振蕩器(上海新波生物技術有限公司)、SYM-BIO EGATA2310 全自動洗板機(上海新波生物技術有限公司)、流式細胞儀 FACSCantoTM Ⅱ(美國BD公司)。

1.3.2 血清hs-CRP、ESR：2組均于清晨空腹時采集2 ml肘靜脈血，予以枸櫞酸鈉抗凝，紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)選取魏氏法測定。同時，2組均于清晨空腹時采集5 mL肘靜脈血，于無抗凝劑的真空采血管內置入，離心半徑、轉速分別為15 cm、3 000 r/min，離心15 min后分離血清，hs-CRP選取散射比濁法測定。

1.3.3 血清IL-17、IL-35測定：2組均于清晨空腹時采集5 ml肘靜脈血，離心半徑、轉速分別為15 cm、3 000 r/min，離心15 min后分離血清，血清IL-17、IL-35選取酶聯免疫吸附法測定。

1.4 觀察指標 觀察2組患者血清hs-CRP、ESR、IL-17及IL-35水平，并選取Pearson 相關分析法分析AS患者血清IL-17、IL-35水平與Bath AS 疾病活動指數評分表(BASDAI)評分、hs-CRP、ESR水平之間的關系。

2 結果

2.1 2組血清炎性活動指標ESR、Hs-CRP水平比較 研究組血清Hs-CRP、ESR水平較對照組更高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組血清炎性活動指標ESR、Hs-CRP水平比較

2.2 2組血清IL-17、IL-35水平比較 研究組較對照組血清IL-17水平更高，IL-35水平更低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組血清IL-17、IL-35水平比較

2.3 AS患者血清IL-17、IL-35與BASDAI評分、hs-CRP、ESR相關性分析 AS患者血清IL-35水平與BASDAI評分、hs-CRP、ESR水平呈負相關(P<0.01)；血清IL-17水平與BASDAI評分、Hs-CRP、ESR水平呈負相關(P<0.01)。見表3。

表3 AS患者血清IL-17、IL-35與BASDAI評分、hs-CRP、ESR相關性分析

2.4 AS患者血清IL-17與IL-35相關性分析 AS患者血清IL-35水平與IL-17水平呈負相關(r=-0.352，P<0.01)。見表4。

表4 AS患者血清IL-17與IL-35相關性分析

3 討論

AS是一種慢性炎癥性自身免疫性病癥，一旦發病極易導致患者殘疾，誘發關節功能喪失及脊柱強直，對患者生活質量及身心健康有嚴重影響，因此早發現、早診斷和早治療具有重要意義[11]。相關研究顯示，CD4+T細胞亞群比例紊亂在AS發生中發揮了重要作用，以Th1/Th2與Treg /Th17細胞免疫失衡為主要表現，而免疫失衡發生原因尚未明確，且細胞因子在AS發病中發揮的作用受到了越來越多的關注[12,13]。

IL-35在一系列病癥中發揮的作用受到了廣泛關注，IL-12家族內除IL-35之外的其他成員均具備促炎功效，而IL-35具備抗炎功效，且就體內缺少EB13的小鼠而言，其體內存在高表達IL-17。同時，IL-35作為一種細胞因素，不僅具備免疫抑制、抗炎等一系列作用，且與多種病癥發生發展密切相關，可對Treg/Th17細胞分化產生調控作用，對Treg細胞增殖具有促進作用，且可對Th17細胞分化及IL-17分泌產生抑制[14]。IL-35多由Treg細胞分泌，經與自身受體有機結合，致使STAT1或者STAT4磷酸化進而發揮其具備的免疫抑制作用，而IL-17作為一種促炎因子，經Th17分泌，其可誘導生發中心產生大量自身抗體，且與相應抗原形成免疫復合物于血管基底膜內沉積，進而發揮組織損傷作用。IL-17與IL-35作為一對有著密切聯系的促炎/抗炎細胞因子，于生理狀態下兩種細胞因子的表達水平處于相對平衡狀態，一旦平衡失調可誘發一系列自身免疫系統病癥。

AS發病過程中IL-17發揮著一定作用，且與AS活動性及嚴重程度有著密切關聯，疾病活動度高的患者其IL-17表達水平更高，所以AS患者中IL-35水平的高表達，一方面可能是因為Th17細胞分泌的IL-17水平上升致使Treg細胞產生的IL-35反應性表達水平升高，于機體免疫反應中發揮著重要的保護作用，在此基礎上確保促炎/抑炎作用處于平衡狀態，另一方面可能是免疫系統病癥中，分泌IL-35且具備免疫抑制作用的Treg細胞數據減少或者功能缺陷，致使IL-35分泌量下降，而為了彌補IL-35免疫抑制功能下降這一缺陷，外周其他可分泌IL-35的細胞過度分泌IL-35，以對抑炎作用予以維持，降低炎性反應對組織產生的侵害。相關研究顯示，將重組IL-35加入CD4+T細胞亞群與胰島細胞共培養體系內，可加快Treg細胞增殖，對Th17細胞分化產生抑制，進而對Treg /Th17比率起到調控作用，進一步增強胰島細胞活性[15]。同時，于膠原誘導的小鼠關節模型內對IL-35進行過繼轉移，可加快Treg細胞增殖，對CD4+CD25-細胞增殖及分化產生抑制，在此基礎上減少IL-17分泌量，加快干擾素產生，以緩解炎性反應，減輕膠原性關節炎。相關研究顯示，刺激Treg細胞后可促使其分泌大量的IL-35，負向調控CD4+T細胞在炎癥性腸病、原發性干燥綜合征、系統性紅斑狼瘡等炎癥性病癥與自身免疫性病癥的發生及發展中具有重要意義，提示AS發生中IL-35可能也扮演著重要角色[16]。

IL-17作為一種炎癥性細胞因子，經Th細胞產生，屬于Th17細胞的主要效應因子，可對中性粒細胞起到招募、活化作用，誘導T細胞激活，并刺激成纖維細胞、巨噬細胞、上皮細胞產生多種細胞因子(IL-1、IL-6及腫瘤壞死因子等)與細胞黏附分子、化學增活素產生，最終致使炎癥發生[17]。IL-17在AS中的作用受到了廣泛關注，AS患者關節、滑液、血清與CD4+T淋巴細胞內IL-17呈高表達，一系列IL-17相關基因已經被確定為AS發展的危險因素，現階段IL-17在AS中的作用研究主要分為兩個方面，一方面為鑒定誘導IL-17分泌的因子，另一方面為鑒定分泌IL-17的細胞類型，多種分泌IL-17的細胞與AD有著緊密聯系，如ILC、骨髓細胞等。相關研究顯示，HLA-B27轉基因大鼠體內的特異性靶向HLA-B27二聚體的單克隆抗體HD5可對HLA-B27二聚體、KIR之間的相互作用產生抑制，使經CD4+T淋巴細胞產生的IL-17、TNF表達水平下降[18]。Lau等[19]在研究中發現，CD8+T淋巴細胞內原型Th1細胞轉錄因子T-bet處于高表達狀態，且與IL-17反應有著緊密聯系；同時，相較于野生型SKG小鼠，TBX21-/-SKG小鼠未發展為脊柱關節炎，其CD8+T淋巴細胞數量顯著減少，提示T-bet對IL-23受體在Th17中的表達產生抑制，可促使T-bet缺陷型小鼠無線分泌IL-17，且CD4+T淋巴細胞活性調節中T-bet發揮著至關重要的作用，尤其是在CD4+T淋巴細胞由固有層向上皮轉移期間的活性，而這一過程中它們獲取CD8a表達并喪失Foxp3表達，維持調節功能。ILC具備有限的克隆性與不變的TCR，且在刺激后可被迅速激活，如γδT細胞、黏膜相關不變T細胞等。Gracey等[20]在相關研究中發現，AS患者相較于健康個體，其MAIT可分娩更高水平的IL-17，且與發炎關節位置聚集，而IL-17水平上升的主要原因為IL-17啟動MAIT，由于IL-7R賦予了AS易感性，因此這一狀況可能延伸至TH17；除此之外，因為AS患者滑膜組織及外周滑液樣本內的IL-17表達水平上升，因此研究IL-17具有可行性。Kenna等[21]在相關研究中提出，AS患者體內IL-17分泌量明顯增加，且IL-23rDEAγδT細胞數量顯著升高。Sherlock等[22]在相關研究中發現，IL-23誘導的脊柱關節炎樣疾病小鼠肌腱內發現了分泌IL-17的CD4-CD8-IL-23r+T淋巴細胞，且這些細胞是組織駐留的Vγ6+γδ-T淋巴細胞，但人體內是否存在還尚未證實。AS患者IL-17水平上調提示了分泌IL-17的免疫細胞整體失調，而來自一系列免疫細胞的IL-17對AS的相對致病性尚未完全明確。相關研究顯示，IL-17水平上升與慢性炎癥性病癥的發生有著密切聯系[23]。

本研究中，研究組較對照組血清IL-35水平明顯更低，且與BASDAI評分呈負相關，而IL-17水平較對照組明顯更高，且與BASDAI評分呈正相關，提示血清IL-35水平變化與IL-17相反，AS患者的病情越重，其血清IL-35水平越低，IL-17水平越高，主要在于IL-35水平下降可進一步弱化Treg細胞分化、增殖能力，致使免疫系統異常活化，最終喪失自身免疫耐受性，且Th細胞過度活化可導致IL-17等炎性介質大量釋放，進一步加重炎性反應，促使疾病進展，在此基礎上在AS發生發展過程中起到介導作用。同時，本研究相關性分析顯示，AS患者血清IL-35水平與IL-17水平呈負相關，進一步說明IL-35水平變化與Th17細胞增殖、IL-17分泌抑制減弱有著密切聯系，通過監測血清IL-17、IL-35水平可反映AS疾病活動度。除此之外，本研究顯示，AS患者血清IL-35水平與IL-17、BASDAI評分、hs-CRP、ESR水平呈負相關；血清IL-17水平與BASDAI評分、hs-CRP、ESR水平呈正相關，提示AS患者血清IL-17水平上升與IL-35水平下降可能間接經細胞免疫或體液免疫促使血清hs-CRP、ESR水平上調，致使AS炎癥發生。

綜上所述，AS患者血清IL-35水平與IL-17水平呈負相關性，且血清IL-17、IL-35水平與疾病活動、炎性活動指標變化密切相關，可用于監測AS疾病活動度；但是，由于本研究以回顧性分析為法，研究病例的選擇上缺乏客觀性，過于主觀，可能存在信息偏倚，加之樣本量較少，結果有待驗證。