知母皂苷AⅢ通過OXCT1-AS1/miR-874-3p抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲的機制研究

莊俊嶸 劉瑾 秦怡瓊

肝癌是我國病死率較高的惡性腫瘤之一，近年來中藥提取物具有抗肝癌的作用，可有效患者術后不良反應，提高患者免疫力，改善患者生活質量等[1,2]。因此，開發有效抗肝癌的中藥對其治療具有重要意義。中藥知母是目前常用的中藥材，知母皂苷AⅢ是知母中的主要甾體皂苷，具有抗炎，降糖，抗腫瘤等作用[3]。研究報道知母皂苷AⅢ能抑制人肺腺癌SPC-A-1細胞的增殖生長[4]。知母皂苷AⅢ可通過抑制PI3K/AKT信號通路誘導急性B淋巴細胞白血病細胞凋亡，進而抑制細胞活力[5]。知母皂苷AⅢ通過干預MAPK及Wnt/β-catenin信號通路而抑制腦膠質瘤U87MG的增殖[6]。知母皂苷AⅢ通過AKT/miR-129-5p軸抑制CTSC的表達來抑制腎癌細胞的轉移[7]。然而知母皂苷AⅢ對肝癌細胞增殖、遷移侵襲的影響及機制尚不清楚。研究報道miR-874-3p通過下調PIN1抑制體外肝癌細胞生長和集落形成，并促進細胞凋亡[8]。生物學軟件預測發現miR-874-3p與lncRNA OXCT1-AS1有結合位點。研究發現OXCT1-AS1在膀胱癌細胞中上調表達，通過miR-455-5p/JAK1信號傳導促進膀胱癌細胞的增殖和侵襲[9]。本實驗旨在研究知母皂苷AⅢ對肝癌細胞惡性生物學行為的影響及其是否與OXCT1-AS1、miR-874-3p有關。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 HCC9204細胞購自美國ATCC；RPMI-1640培養基、MTT試劑盒、結晶紫染色液購自美國Sigma公司；知母皂苷AⅢ購自上海賽可銳生物科技有限公司；Transwell小室、基質膠購自美國康寧公司；Trizol試劑、熒光定量試劑盒購自日本Takara公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海群己生物科技有限公司。

1.2 細胞處理與分組 HCC9204細胞用RPMI-1640培養基常規培養，分別用0、4、8、16 μmol/L的知母皂苷AⅢ處理，作為不同濃度知母皂苷AⅢ組，其中16 μmol/L的知母皂苷AⅢ處理的細胞又記為知母皂苷AⅢ組。將si-NC、si-OXCT1-AS1、pcDNA、pcDNA-OXCT1-AS1轉染至HCC9204細胞，用RT-qPCR檢測OXCT1-AS1表達水平，以確認轉染效率。將si-NC、si-OXCT1-AS1轉染至HCC9204細胞，記為si-NC組、si-OXCT1-AS1組；將pcDNA-OXCT1-AS1、miR-874-3p inhibor轉染至HCC9204細胞后用16 μmol/L的知母皂苷AⅢ處理，記為知母皂苷AⅢ+pcDNA-OXCT1-AS1組、知母皂苷AⅢ+miR-874-3p inhibor組。

1.3 MTT檢測細胞增殖抑制率 各組細胞培養48 h，按試劑盒說明操作，酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。計算細胞增殖抑制率(%)。

1.4 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成數 各組細胞接種于6孔板，培養2周，甲醇固定后用結晶紫染色，光學顯微鏡下計數>50個細胞的集落。

1.5 Transwell檢測遷移與侵襲細胞數 遷移：取100 μl 無血清培養液懸浮的細胞至Transwell上室，下室加含血清培養液，培養24 h，0.1%結晶紫染色，顯微鏡下隨機選取五個視野記數遷移細胞。侵襲：用基質膠包被Transwell上室，其余同遷移操作。

1.6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測OXCT1-AS1和miR-874-3p的表達水平 提取各組總RNA，合成cDNA后以GAPDH和U6為內參進行PCR，相對表達量用2-△△Ct法計算。

1.7 雙熒光素酶報告實驗 將OXCT1-AS1野生型和突變型熒光素酶載體分別與miR-NC和miR-874-3p共轉染至HCC9204細胞，按照說明書檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 知母皂苷AⅢ對HCC9204增殖遷移侵襲的影響 不同濃度知母皂苷AⅢ處理后，隨著藥物濃度增加，HCC9204細胞增殖抑制率逐漸升高，克隆形成數、遷移和侵襲細胞數逐漸減少，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表1。

表1 知母皂苷AⅢ抑制HCC9204增殖遷移侵襲

圖1 知母皂苷AⅢ抑制HCC9204遷移侵襲(結晶紫染色×200)

2.2 知母皂苷AⅢ對HCC920中OXCT1-AS1、miR-874-3p表達的影響 不同濃度知母皂苷AⅢ處理后，隨著藥物濃度增加，OXCT1-AS1表達水平逐漸降低，miR-874-3p表達水平逐漸升高(P<0.05)。見表2。

表2 知母皂苷AⅢ抑制OXCT1-AS1促進miR-874-3p的表達

2.3 OXCT1-AS1、miR-874-3p靶向關系驗證 Starbase預測顯示OXCT1-AS1和miR-874-3p有互補序列；miR-874-3p與WT-OXCT1-AS1共轉染后細胞熒光素酶活性降低(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 OXCT1-AS1和miR-874-3p的互補序列

表3 熒光素酶活性

2.4 OXCT1-AS1處理后轉染效率的檢測 si-OXCT1-AS1組OXCT1-AS1表達水平低于si-NC組(P<0.05)；pcDNA-OXCT1-AS1組OXCT1-AS1表達水平高于pcDNA組。見表4。

表4 OXCT1-AS1表達的檢測

2.5 下調OXCT1-AS1對HCC9204增殖遷移侵襲的影響 與si-NC組比較，si-OXCT1-AS1組miR-874-3p表達水平升高，HCC9204增殖抑制率升高，克隆形成細胞數、遷移和侵襲細胞數減少(P<0.05)。見圖3，表5。

圖3 下調OXCT1-AS1抑制HCC9204遷移侵襲(結晶紫染色×200)

表5 下調OXCT1-AS1抑制HCC9204增殖遷移侵襲

2.5 OXCT1-AS1過表達或miR-874-3p抑制對知母皂苷AⅢ處理的HCC920增殖遷移侵襲的作用 與知母皂苷AⅢ組比較，知母皂苷AⅢ+pcDNA-OXCT1-AS1組和知母皂苷AⅢ+miR-874-3p inhibor組miR-874-3p表達水平降低，HCC9204增殖抑制率降低，克隆形成細胞數、遷移和侵襲細胞數增多，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4，表6。

表6 OXCT1-AS1過表達或miR-874-3p抑制可逆轉知母皂苷AⅢ對HCC920增殖遷移侵襲的抑制作用

圖4 OXCT1-AS1過表達或miR-874-3p抑制可逆轉知母皂苷AⅢ對HCC920遷移侵襲的抑制作用(結晶紫染色×200)

3 討論

中醫藥聯合分子靶向藥物是當前治療肝癌的一個重要治療手段，值得臨床推廣運用[10,11]。研究報道知母皂苷AⅢ通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路誘導T細胞急性淋巴細胞白血病Jurkat細胞的凋亡和自噬[12]。高濃度的知母皂苷AⅢ可誘導肺癌細胞凋亡[13]。知母皂苷AⅢ可通過抑制STAT3和ERK1/2通路誘導胰腺癌細胞凋亡并抑制細胞增殖[14]。知母皂苷AⅢ通過激活ATM/Chk2和p38 MAPK信號通路誘導乳腺癌G2/M期阻滯和細胞凋亡[15]。以上研究表明知母皂苷AⅢ具有抗多種腫瘤的作用。本實驗表明知母皂苷AⅢ可濃度依賴性抑制HCC920細胞增殖、遷移和侵襲。

研究報道OXCT1-AS1在膠質母細胞瘤組織中上調表達，且預示著預后不良；抑制 OXCT1-AS1表達通過調節miR-195-5p/CDC25A軸抑制膠質母細胞瘤細胞增殖、遷移和侵襲；是一種特異性腫瘤標志物，腫瘤治療的潛在靶點[16]。本實驗結果：表明下調OXCT1-AS1可抑制HCC920細胞增殖、遷移和侵襲。生物學軟件預測發現OXCT1-AS1與miR-874-3p有結合位點。且本實驗證實OXCT1-AS1可靶向調控miR-874-3p。已有研究報道miR-874-3p可抑制肝癌細胞生長[8]。提示，OXCT1-AS1可通過調控miR-874-3p影響肝癌進展。

此外，本實驗結果還提示，知母皂苷AⅢ可通過調控OXCT1-AS1/miR-874-3p抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。