CX3CL1/FKN、CC16、GULP1在慢性阻塞性肺疾病合并肺氣腫中的表達及相關性

柏發蕊 許棟

不可逆的氣流限制是慢性阻塞性肺疾病(Chrinic obstructive pulimonary disease，COPD)主要病理特征，與肺對有毒粒子/氣體的異常炎性反應相關[1]。研究表明，隨著生活方式、環境的發展，COPD已成為導致死亡的主要病因，且其發病率、病死率趨于逐年升高，對社會健康造成嚴重威脅[2,3]。肺氣腫作為常見影像學表現，已被認定是其重要表型。在COPD合并肺氣腫發病過程中肺部產生異常炎性反應釋放炎性介質，如白介素、C反應蛋白等，是評估炎性反應的常用評價指標，但缺乏可靠的預測診斷指標[4,5]。相關研究表明，血清不規則趨化因子(CX3CL1/FKN)作為跨膜糖蛋白，其生化特征、染色體定位等均表明其在白細胞向內皮細胞趨化的分子控制機制中發揮獨特作用，而由Clara細胞分泌合成的Clara 細胞分泌蛋白(CC16)具有抗炎、免疫調節活性，是促進COPD發生、發展的重要因素[6,7]。有研究指出，GULP1作為調控凋亡細胞的吞噬關鍵蛋白，在COPD凋亡細胞清理缺陷中發揮重要作用[8]。基于此，通過檢測COPD合并肺氣腫患者血清CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表達，了解COPD合并肺氣腫發生情況及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選取我院2019年1月至2021年1月收治的98例慢性阻塞性肺疾病患者為觀察組，其中男52例，女46例；年齡45～73歲，平均年齡(59.00±11.90)歲；同期選取100例體檢健康人員為對照組，其中男52例，女48例；年齡43～76歲，平均年齡(59.5±14.02)歲。按照是否合并肺氣腫將觀察組分為COPD患者43例，COPD合并肺氣腫患者55例。本研究經醫院倫理委員會批準，患者或家屬知情并簽署同意書。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：符合《慢性阻塞性肺疾病基層診療指南(實踐版·2018)》中COPD相關診斷標準[9]；均為穩定期COPD患者，經影像學檢查確診；健康人員身體健康無任何疾病。

1.2.2 排除標準：心肺、肝腎等臟器功能嚴重損傷者；合并基礎疾病、免疫障礙、血液系統疾病者；合并惡性腫瘤者；既往有氣管插管病史；合并影響呼吸系統的嚴重疾病者；近期內吸入/口服糖皮質激素者；長效應用抗膽堿能藥物。

1.3 觀察指標

1.3.1 肺功能檢測:采用Master Screen肺功能儀檢測用力肺活量(forced vital capacity，FVC)、第1秒用力呼氣量(forced expiratory volume in first second，FEV1)、FEV1/FVC%水平，均測量>3次，保留3次最佳數值，取其平均值。

1.3.2 血樣采集:于接診當日抽取所有受試者5 ml空腹靜脈血，置于EDTA抗凝管中，離心處理10 min(轉速：3 000 r/min，離心半徑12 cm)，分離上清，于-20℃下低溫保存。

1.3.3 CX3CL1/FKN、CC16含量測定:采用酶聯免疫吸附法檢測受試者CX3CL1/FKN、CC16含量，檢測時酶標板分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔，每孔內均加入50 μl稀釋液，空白孔、標準孔、待測樣品孔內分別加入樣品稀釋液、標準品、待測樣片各 50 μl，輕晃均勻，酶標板覆膜，室溫孵育2 h。孵育結束后棄孔內液體，甩干，采用洗滌液反復清洗反應板。每孔內加入CX3CL1/FKN、CC16檢測液100 μl，重新覆膜，室溫孵育1 h，棄孔內液體，甩干、洗滌反應板，每孔內加入100 μl底物溶液，室溫避光顯色30 min，加入50 μl終止液，輕彈酶標板終止反應。

1.3.4 GULP1表達測定:患者入院接受常規纖維支氣管鏡檢查時，首先根據病情選擇刷檢部位，操作時利用一次性無菌細胞刷輕輕刷取氣道上皮，將刷檢下來的細胞收集于培養液中，離心洗滌后，將其配置為細胞懸液，并進行擴大培養，將細胞調制為所需濃度的細胞懸液用于檢測。采用免疫組化SP染色法對受試者GULP1表達進行檢測，脫蠟、水化等處理后，將其在0.01 mol/L、95℃的枸櫞酸緩沖液中浸泡，并進行熱修復，3% H2O2環境下培育10 min，滴入山羊血清，26℃環境中培養30 min，抽離封閉液、添加一抗(鼠抗單克隆抗體GULP1，1∶1 000)，4℃過夜培養，PBS洗滌，加入二抗(鼠抗單克隆抗體β-actin，1∶5 000)，37℃恒溫條件下孵育30 min，PBS洗滌，顯色，蘇木精復染后洗滌、脫水、透明、封片。采用雙盲法閱片將GULP1蛋白陽性細胞所占總細胞比例分為4等級，陰性：<5%；弱陽性：5%～25%；中等陽性：26%～50%；強陽性：>50%，分別記為0、1、2、3分。每樣本統計20個肺泡腔巨噬細胞數量，評價每個肺泡腔≥10個巨噬細胞為肺泡巨噬細胞高水平，<10個巨噬細胞為肺泡巨噬細胞低水平。

2 結果

2.1 2組患者肺功能指標比較 與對照組比較，觀察組患者FVC、FEV1、FEV1/FVC水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)；且COPD合并肺氣腫患者FVC、FEV1、FEV1/FVC水平低于COPD患者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組患者肺功能指標比較

2.2 2組患者CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表達比較 與對照組比較，觀察組患者CX3CL1/FKN、GULP1表達水平升高，CC16水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)；且COPD合并肺氣腫患者CX3CL1/FKN、GULP1表達高于COPD患者，CC16水平低于COPD患者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表達比較

2.3 CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表達與COPD合并肺氣腫肺功能相關性分析 以CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表達進行相關性分析，結果顯示CX3CL1/FKN、GULP1與COPD合并肺氣腫FVC、FEV1、FEV1/FVC呈負相關(P<0.05)，CC16與COPD合并肺氣腫FVC、FEV1、FEV1/FVC呈正相關(P<0.05)。見表3。

表3 CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表達與COPD合并肺氣腫肺功能相關性分析

2.4 CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表達與病情嚴重程度相關性分析 以CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表達進行相關性分析，COPD合并肺氣腫患者CX3CL1/FKN、GULP1與病情嚴重程度呈正相關(P<0.05)，CC16與病情嚴重程度呈負相關(P<0.05)。見表4。

表4 CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表達與病情嚴重程度相關性分析

2.5 COPD合并肺氣腫影響因素的多元Logistic回歸分析 將COPD合并肺氣腫發病(輕度=0，中重度=1)作為因變量，將 CX3CL1/FKN、CC16、GULP1作為自變量，賦值升高設為1，正常設為0，納入二分類多因素Logistic回歸模型分析，結果顯示，CX3CL1/FKN、CC16、GULP1為影響COPD合并肺氣腫發病的因素(P<0.05)。見表5。

表5 COPD合并肺氣腫影響因素的多元Logistic回歸分析

2.6 CX3CL1/FKN、CC16、GULP1在COPD合并肺氣腫中的相關性分析 CX3CL1/FKN與CC16呈負相關(r=-0.597，P=0.001)；CX3CL1/FKN與GULP1呈正相關(r=0.712，P=0.001)；CC16與GULP1呈負相關(r=-0.702，P=0.001)。見表6。

表6 CX3CL1/FKN、CC16、GULP1在COPD合并肺氣腫中的相關性分析

3 討論

肺氣腫作為COPD重要表型，主要由細支氣管、肺泡壁彈性下降及過度膨脹破裂導致，可導致呼吸衰竭甚至死亡，嚴重威脅患者生命安全，故COPD診斷對預防COPD合并肺氣腫具有獨特意義[10]。

本研究指出，COPD合并肺氣腫患者CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表達高于COPD患者、健康者，提示CX3CL1/FKN、CC16、GULP1可能參與COPD合并肺氣腫的發生發展。研究表明，炎性反應可促進COPD合并肺氣腫的發展過程。CX3CL1/FKN作為常見炎性因子，可趨化、激活白細胞參與炎性反應的各個階段，促進炎癥發生，與肺部疾病的發展存在緊密關聯[11,12]。相關研究表明，CX3CL1/FKN在COPD合并肺氣腫患者血清中水平明顯高于COPD患者，證實COPD合并肺氣腫患者存在慢性炎性反應，導致大量炎性因子生產，對疾病進展造成影響[13,14]。CC16主要由Clara細胞分泌，具有氣道保護、抗炎、抗氧化及抗腫瘤作用，并參與肺部疾病發病的病理過程[15]。相關研究表明，在COPD小鼠氣道中CC16免疫染色減少，并與肺部炎癥、肺泡細胞凋亡、氣道重塑存在顯著關聯[16]。相關研究指出，CC16可能參與COPD合并肺氣腫的發生，對患者肺功能指標造成影響[17,18]。本研究證實CX3CL1/FKN、CC16參與COPD合并肺氣腫發病的病理過程。GULP1已證實參與關節炎、精神分裂癥及癌癥等多種疾病發生發展，但臨床中有關GULP1與COPD疾病進展的研究較少[19,20]。有學者指出，GULP1在COPD不同階段肺組織支氣管上皮細胞中表達存在差異，且與疾病嚴重程度呈正相關[21]。本研究表明，COPD合并肺氣腫患者CX3CL1/FKN、GULP1高于COPD患者、健康者，CC16低于COPD患者、健康者，由此表明CX3CL1/FKN、CC16、GULP1參與COPD合并肺氣腫的生理病理過程。同時研究證實CX3CL1/FKN、CC16、GULP1與肺功能指標變化及病情嚴重程度存在相關性，通過檢測上述指標水平，可對COPD合并肺氣腫發生風險進行早期預測，做好預防措施，從而改善COPD合并肺氣腫發病率及病死率。

綜上所述，CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表達與肺功能指標、病情嚴重程度存在明顯相關性，提示其表達變化能夠有效COPD合并肺氣腫的發生風險，對COPD合并肺氣腫的預防具有重要裨益，有望成為評估COPD疾病診斷及預后的生物標志物，為COPD合并肺氣腫提供新的臨床途徑。