circ_0000218靶向miR-1278調控肺癌H1299細胞的增殖、遷移和侵襲

王靜 邵小美 譚德倫

肺癌是較普遍的惡性腫瘤，是最常見的全球癌癥相關死亡原因[1]。由于缺乏早期臨床癥狀，大多數肺癌患者確診時已為晚期，失去了最佳治療時期。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌最常見的亞型，包括大細胞癌、鱗狀細胞癌和腺癌，約占肺癌的85%[2]。不良飲食、吸煙、職業暴露和遺傳易感性是非小細胞肺癌的主要危險因素[3]。盡管臨床治療手段已取得一定進展，但NSCLC患者預后仍較差，5年生存率較低。耐藥性、腫瘤轉移等是治療NSCLC的主要障礙[4]。因此，亟待研究NSCLC病理機制和尋找新的治療策略。環狀RNA(circRNAs)是一種新型單鏈非編碼RNA轉錄本，具有序列保守、結構穩定、豐度高和特異性高等特點[5]。研究發現，沉默circ_0000218可抑制喉鱗狀細胞癌細胞活力，促進細胞凋亡[6]。circ_0000218高表達與大腸癌T分期和局部淋巴結轉移增加相關，下調circ_0000218可抑制大腸癌細胞的增殖和轉移[7]。過表達circ_0000218可促進腎細胞癌細胞的增殖和轉移[8]。下調circ_0000218可抑制宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲[9]。然而，circ_0000218在NSCLC中的作用筆者尚未見報道。Circinteractome預測顯示，circ_0000218與miR-1278 之間存在核苷酸結合位點。有研究報道，miR-1278在肺癌細胞中低表達[10]。因此，本實驗旨在研究circ_0000212在NSCLC中的作用以及其是否通過調控miR-1278表達影響NSCLC細胞H1299的增殖、遷移和侵襲。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2017年1月至2019年1月經病理檢測為肺癌患者30例，獲得原發性肺癌組織及相應癌旁組織，患者均知情且同意，手術切除后立即將樣本保存在-80℃。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 材料 肺癌細胞株H1299購自購自中科院上海細胞庫；DMEM培養液、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司；Trziol、反轉錄、qRT-PCR試劑購自美國Thermo Fisher公司；MTT 試劑盒購自美國Sciencell公司；Transwell小室日本Chemicon公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(BCA)和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；

1.3 細胞轉染與分組 取對數生長期H1299細胞，將si-NC、si-circ_0000218、miR-NC、miR-1278分別轉染至H1299細胞，記為si-NC組、si-circ_0000218組、miR-NC組、miR-1278組；將si-circ_0000218分別與anti-miR-NC、anti-miR-1278共轉染至H1299細胞，記為si-circ_0000218+anti-miR-NC組、si-circ_0000218+anti-miR-1278組。

1.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA，circ_0000218和miR-1278分別以GAPDH和U6為內參，相對表達量采用2-△△Ct法計算。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.5 MTT 取各組H1299細胞(2.5×104個/ml)，接種于96孔板(100 μl/L)，培養48 h后，加入MTT溶液20 μl/孔，培養4 h，棄上清，加入DMSO 150 μl/孔，室溫震蕩孵育5 min，酶標儀檢測450 nm處的OD值。

1.6 Transwell 將各組H1299細胞接種于Transwell小室上室(5×104個/孔)，下室加入含10%胎牛血清的培養液600 μl，在37℃下孵育24 h后，用棉簽擦去未穿膜細胞。多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色。置于顯微鏡下隨機選取5個視野計數。

1.7 免疫印跡法(Western blot) 提取各組H1299細胞總蛋白，BCA進行定量。進行SDS-PAGE后轉移至PVDF上，5%脫脂牛奶室溫封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，暗室中曝光顯影，定影，Image J軟件分析目的蛋白的相對表達量。

1.8 雙熒光素酶報告基因實驗 構建circ_0000218野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-circ_0000218和MUT-circ_0000218，將其分別與miR-NC和miR-1278共轉染至H1299細胞中，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 干擾circ_0000218表達對肺癌H1299細胞增殖、遷移和侵襲的影響 H1299細胞中轉染si-circ_0000218后，si-circ_0000218組circ_0000218表達水平降低，H1299細胞的OD值、遷移、侵襲細胞數以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平降低，p21表達水平升高(P<0.05)。見表1、2，圖1。

圖1 干擾circ_0000218表達對肺癌H1299細胞增殖、遷移和侵襲的影響；A 增殖、遷移和侵襲相關蛋白的表達；B 肺癌H1299細胞的遷移和侵襲(結晶紫染色×200)

表1 干擾circ_0000218表達對肺癌H1299細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.2 circ_0000218和miR-1278在肺癌組織中的表達 肺癌組織中circ_0000218高于癌旁組織，miR-1278表達水平低于癌旁組織(P<0.05)。見表3。

表2 干擾circ_0000218表達對肺癌H1299細胞增殖、遷移和侵襲相關蛋白的影響

表3 circ_0000218和miR-1278在肺癌組織中的表達

2.3 circ_0000218靶向調控miR-1278的表達(Circinteractome Predicted) Circinteractome的數據預測顯示，circ_0000218與miR-1278之間存在互補核苷酸序列。與轉染miR-NC的WT-circ_0000218比較，轉染miR-1278的熒光素酶活性降低(P<0.05)；circ_0000218靶向負調控miR-1278的表達(P<0.05)。見表4、5，圖2。

表4 雙熒光素酶報告實驗

表5 circ_0000218調控miR-1278表達

圖2 circ_0000218的序列中含有與miR-1278互補的核苷酸序列

2.4 過表達miR-1278對肺癌H1299細胞增殖、遷移和侵襲的影響 H1299細胞中轉染miR-1278后，miR-1278組miR-1278表達水平升高，H1299細胞的OD值、遷移、侵襲細胞數以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平降低，p21表達水平升高(P<0.05)。見表6、7，圖3。

圖3 過表達miR-1278對肺癌H1299細胞增殖、遷移和侵襲的影響;A 增殖、遷移和侵襲相關蛋白的表達；B 肺癌H1299細胞的遷移和侵襲(結晶紫染色×200)

表6 過表達miR-1278對肺癌H1299細胞增殖、遷移和侵襲的影響

表7 過表達miR-1278對肺癌H1299細胞增殖、遷移和侵襲相關蛋白表達的影響

2.5 下調miR-1278逆轉了干擾circ_0000218表達對肺癌H1299細胞增殖、遷移和侵襲的影響 H1299細胞中共轉染后，si-circ_0000218+anti-miR-1278組miR-1278表達水平降低，H1299細胞的OD值、遷移、侵襲細胞數以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平升高，p21表達水平降低(P<0.05)。見圖4，表8、9。

表8 下調miR-1278逆轉了干擾circ_0000218表達對肺癌H1299細胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖4 下調miR-1278逆轉了干擾circ_0000218表達對肺癌H1299細胞增殖、遷移和侵襲的影響；A 增殖、遷移和侵襲相關蛋白的表達；B 肺癌H1299細胞的遷移和侵襲(結晶紫染色×200)

3 討論

越來越多研究發現，circRNAs的異常表達與腫瘤進展密切相關。敲除circ_0003221可抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT，并誘導細胞周期阻滯[11]。上調circ0001686可促進前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲[12]。干擾circ_0072088可抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡[13]。過表達circ_0030586可抑制膀胱癌細胞的增殖和干細胞形成[14]。在甲狀腺乳頭狀癌組織中，circ_0137287表達降低，其低表達預示著低生存率，上調circ_0137287抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖、遷移、侵襲和有氧糖酵解，并誘導凋亡[15]。circ_0069244低表達與NSCLC患者生存期短和腫瘤組織學分級差有關，過表達circ_0069244抑制NSCLC細胞增殖和遷移[16]。與上述研究結果相似，本結果提示干擾circ_0000218表達可抑制H1299細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

表9 下調miR-1278逆轉了干擾circ_0000218表達對肺癌H1299細胞增殖、遷移和侵襲的影響

研究表明，circ_0000218可作為競爭性內源RNAs吸附microRNAs，并調控其下游基因的表達[6-8]。本實驗的Circinteractome預測顯示，circ_0000218與miR-1278之間含有互補核苷酸序列，雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，WT-circ_0000218中轉染miR-1278的熒光素酶活性顯著降低，且circ_0000218負調控miR-1278表達。眾多研究發現，microRNAs與肺癌細胞的惡性生物學行為相關[17]。

有數據顯示，miR-637作為一種腫瘤抑制因子，抑制NSCLC的細胞增殖、遷移和侵襲[18]。也有發現miR-486-5p在NSCLC組織和細胞中表達下調，上調miR-486-5p通過抑制上皮-間充質轉化抑制NSCLC腫瘤的生長和轉移[19]。在吉非替尼耐藥NSCLC細胞中，miR-133a-3p表達明顯下調，過表達miR-133a-3p增加了吉非替尼敏感性[20]。

miR-126-5p在NSCLC組織、順鉑耐藥NSCLC組織和細胞中表達下調，過表達miR-126-5p抑制順鉑耐藥NSCLC細胞增殖，促進細胞凋亡和增強細胞順鉑敏感性[21]。過表達miR-144-3p通過下調COL11A1表達抑制肺腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[22]。

本實驗結果顯示，與癌旁組織比較，肺癌組織中miR-1278表達降低；過表達miR-1278降低了H1299細胞的OD值、遷移、侵襲細胞數以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9水平，升高了p21水平。提示過表達miR-1278可抑制H1299細胞的增殖、遷移和侵襲能力。進一步研究發現，下調miR-1278逆轉了干擾circ_0000218表達對肺癌H1299細胞增殖、遷移和侵襲的影響，H1299細胞的OD值、遷移、侵襲細胞數以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9水平升高，p21水平降低。提示circ_0000218可能通過靶向調控miR-1278表達影響H1299細胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，circ_0000218在肺癌組織中表達上調，干擾circ_0000218表達可能通過靶向上調miR-1278抑制肺癌H1299細胞的增殖、遷移和侵襲。circ_0000218可能是新的治療靶點，還有待進一步研究。