circ_0000069通過靶向miR-1182調控骨肉瘤MG-63細胞增殖、遷移和侵襲的機制研究

王玉萍 王振 張愛忠

骨肉瘤是一種原發性惡性骨腫瘤，擴散迅速，最常見于兒童和青少年[1,2]。在發病位置方面，骨肉瘤常見于長骨干骺端，如股骨遠端、脛骨近端和肱骨近端[3]。盡管骨肉瘤的早期診斷和聯合治療已有所發展，并且數據顯示患者5年生存率顯著提高，但復發性和轉移性骨肉瘤患者的預后仍較差[4]。截肢雖可挽救患者生命，但也嚴重影響了患者身心健康[5]。因此，研究骨肉瘤病理機制，尋找新的分子標志物，對骨肉瘤的早期診斷和治療具有重要意義。環狀RNA(circRNAs)是一種新型單鏈非編碼RNA轉錄本，與人類多種腫瘤的發生發展密切相關。研究發現，敲除circ_0000069可顯著抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲[6]。circ_0000069在宮頸癌中表達上調，與患者淋巴結轉移及預后不良密切相關，可促進宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲[7]。在胰腺癌組織和細胞系中，circ_0000069表達明顯上調，下調其可誘導胰腺癌細胞凋亡和細胞周期阻滯，抑制細胞增殖、遷移、侵襲和異種移植瘤生長[8]。Circinteractome預測顯示，circ_0000069與miR-1182 之間存在核苷酸結合位點。研究報道，miR-1182在骨肉瘤組織和細胞中低表達[9]。因此，本實驗旨在研究circ_0000212在骨肉瘤中的作用及其是否可通過調控miR-1182表達影響骨肉瘤細胞MG-63的增殖、遷移和侵襲。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2017年1月至2019年1月經病理檢測為骨肉瘤的患者30例，獲得原發性骨肉瘤組織及相應癌旁組織，每位患者均知情且同意，手術切除后立即將樣本保存在-80℃。本研究經本院倫理委員會批準。

1.2 材料 骨肉瘤細胞株MG-63購自中科院上海細胞庫；DMEM培養基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；Trziol試劑、反轉錄、qRT-PCR試劑盒購自日本Takara公司；MTT試劑盒購自美國Sciencell公司；Transwell小室購于美國密理博公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(BCA)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；

1.3 細胞轉染與分組 取對數生長期MG-63細胞，將si-NC、si-circ_0000069、miR-NC、miR-1182分別轉染至MG-63細胞，記為si-NC組、si-circ_0000069組、miR-NC組、miR-1182組；將si-circ_0000069分別與anti-miR-NC、anti-miR-1182共轉染至MG-63細胞，記為si-circ_0000069+anti-miR-NC組、si-circ_0000069+anti-miR-1182組。

1.4 RT-qPCR 提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA，circ_0000069、miR-1182分別以GAPDH、U6為內參，相對表達量采用2-△△Ct法計算。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.5 MTT 取各組MG-63細胞(2.5×104個/ml)，接種于96孔板(100 μl/L)，培養48 h后，加入MTT溶液20 μl/孔，培養4 h，棄上清，加入DMSO 150 μl/孔，室溫震蕩孵育5 min，酶標儀檢測450 nm處的OD值。

1.6 Transwell 將各組MG-63細胞接種于Transwell小室上室(5×104個/孔)，加入含10%胎牛血清培養液600 μl于下室，37℃下孵育24 h后，用棉簽擦去未穿膜細胞。多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色。置于顯微鏡下隨機選取5個視野計數。

1.7 Western blot 提取各組MG-63細胞總蛋白，BCA定量。進行SDS-PAGE后轉移至PVDF上，5%脫脂牛奶室溫封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，暗室中曝光顯影，定影，Image J軟件分析目的蛋白的相對表達量。

1.8 雙熒光素酶報告基因實驗 構建circ_0000069野生型、突變型熒光素酶表達載體WT-circ_0000069、MUT-circ_0000069，將其分別與miR-NC、miR-1182共轉染至MG-63細胞，按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 circ_0000069和miR-1182在骨肉瘤組織中的表達 骨肉瘤組織中circ_0000069高于癌旁組織，miR-1182表達低于癌旁組織(P<0.05)。見表1。

表1 circ_0000069和miR-1182在骨肉瘤組織中的表達

2.2 敲除circ_0000069對骨肉瘤MG-63細胞增殖、遷移和侵襲的影響 轉染si-NC、si-circ_0000069至MG-63細胞后，si-circ_0000069組circ_0000069表達降低，MG-63細胞的OD值、遷移、侵襲細胞數以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達降低，p21表達升高(P<0.05)。見圖1，表2、3。

圖1 敲除circ_0000069對骨肉瘤MG-63細胞增殖、遷移和侵襲的影響；A 骨肉瘤MG-63細胞的遷移和侵襲(結晶紫染色×200)；B 增殖、遷移和侵襲相關蛋白的表達

表2 敲除circ_0000069對骨肉瘤MG-63細胞增殖、遷移和侵襲的影響

表3 敲除circ_0000069對骨肉瘤MG-63細胞增殖、遷移和侵襲相關蛋白的影響

2.3 circ_0000069靶向調控miR-1182的表達(Circinteractome Predicted) Circinteractome預測顯示，circ_0000069的序列中含有與miR-1182互補的核苷酸序列。與轉染miR-NC的WT-circ_0000069比較，轉染miR-1182的熒光素酶活性降低(P<0.05)；過表達和沉默circ_0000069分別下調和上調miR-1182表達(P<0.05)。見圖2，表4、5。

表4 雙熒光素酶報告實驗

圖2 circ_0000069的序列中含有與miR-1182互補的核苷酸序列

2.4 過表達miR-1182對骨肉瘤MG-63細胞增殖、遷移和侵襲的影響 轉染miR-NC、miR-1182至MG-63細胞后，miR-1182組miR-1182表達升高，MG-63細胞的OD值、遷移、侵襲細胞數以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達降低，p21表達升高(P<0.05)。見圖3，表6、7。

表5 circ_0000069調控miR-1182表達

圖3 過表達miR-1182對骨肉瘤MG-63細胞增殖、遷移和侵襲的影響；A 骨肉瘤MG-63細胞的遷移和侵襲(結晶紫染色×200)；B 增殖、遷移和侵襲相關蛋白的表達

表6 過表達miR-1182對骨肉瘤MG-63細胞增殖、遷移和侵襲的影響

表7 過表達miR-1182對骨肉瘤MG-63細胞增殖、遷移和侵襲相關蛋白表達的影響

2.5 下調miR-1182逆轉了敲除circ_0000069對骨肉瘤MG-63細胞增殖、遷移和侵襲的影響 共轉染si-circ_0000069、anti-miR-NC與si-circ_0000069、anti-miR-1182至MG-63細胞后，si-circ_0000069+anti-miR-1182組miR-1182表達降低，MG-63細胞的OD值、遷移、侵襲細胞數以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達升高，p21表達降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4，表8、9。

圖4 下調miR-1182逆轉了敲除circ_0000069對骨肉瘤MG-63細胞增殖、遷移和侵襲的影響；A 骨肉瘤MG-63細胞的遷移和侵襲(結晶紫染色×200)；B 增殖、遷移和侵襲相關蛋白的表達

表8 下調miR-1182逆轉了敲除circ_0000069對骨肉瘤MG-63細胞增殖、遷移和侵襲的影響

表9 下調miR-1182逆轉了敲除circ_0000069對骨肉瘤MG-63細胞增殖、遷移和侵襲的影響

3 討論

circ_0000658在骨肉瘤組織和細胞系中低水平表達，沉默circ_0000658表達可促進骨肉瘤細胞周期進展、增殖、侵襲和遷移，抑制骨肉瘤細胞凋亡[10]。上調circ_0008792可抑制骨肉瘤細胞遷移和侵襲，促進細胞凋亡[11]。circ_HIPK3在骨肉瘤細胞系中穩定下調，circ_HIPK3表達與Enneking分期和肺轉移顯著相關，過表達circ_HIPK3在體外顯著抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲[12]。circ_0001785在骨肉瘤細胞系中高表達，敲除circ-0001785可降低骨肉瘤細胞的增殖能力，并誘導細胞凋亡[13]。circ_001621可促進骨肉瘤細胞增殖、遷移以及體內骨肉瘤轉移[14]。在骨肉瘤細胞系和組織中，circ_001422表達顯著增加，其高表達與晚期臨床分期、腫瘤大小、遠處轉移和總體生存率顯著相關，敲除circ_001422可抑制骨肉瘤細胞的增殖和轉移，并促進細胞凋亡[15]。circ_0005909高表達與骨肉瘤患者低生存率有關。干擾circ_0005909表達可抑制體內腫瘤生長，抑制體外骨肉瘤細胞的活力、集落形成、遷移、侵襲和EMT[16]。circ_0000282與骨肉瘤患者Enneking分期正相關，與腫瘤分化程度負相關，過表達circ_0000282可促進骨肉瘤細胞增殖，抑制細胞凋亡[17]。與上述研究結果相似，本實驗結果提示敲除circ_0000069可抑制MG-63細胞的增殖、遷移和侵襲。

研究表明，circ_0000069可作為競爭性內源RNAs吸附microRNAs，并調控其下游基因的表達[7]。本實驗Circinteractome預測顯示，circ_0000069與miR-1182 之間存在核苷酸結合位點，雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，在WT-circ_0000069中，轉染miR-1182的熒光素酶活性降低，且circ_0000069負調控miR-1182表達。研究表明。上調miR-1182可抑制宮頸癌HeLa細胞活力、遷移和侵襲能力[18]。過表達miR-1182可顯著抑制膀胱癌細胞的增殖、集落形成和侵襲能力[19]。miR-1182可抑制胃癌細胞的增殖和轉移潛能[20]。據顯示，miR-1182在卵巢癌組織中表達下調，上調miR-1182可抑制卵巢癌細胞的增殖、侵襲和轉移能力[21]。本實驗結果提示circ_0000069可能通過靶向調控miR-1182表達影響MG-63細胞的增殖、遷移和侵襲。與前人研究結果[18-21]一致。

綜上所述，circ_0000069在骨肉瘤組織中高表達，敲減circ_0000069可能通過靶向上調miR-1182抑制骨肉瘤MG-63細胞的增殖、遷移和侵襲。circ_0000069可能是骨肉瘤的新治療靶點。