抗咪唑啉酮類除草劑基因ALS627N改良粳稻品種除草劑抗性研究

李夢臣， 馮志明，2， 崔 傲， 王廣達， 許志文， 黃 濤， 丁煒宸， 胡珂鳴，2， 陳宗祥，2， 左示敏，2

(1.揚州大學農學院/江蘇省作物基因組學和分子育種重點實驗室/植物功能基因組學教育部重點實驗室，江蘇揚州 225009；2.揚州大學江蘇省糧食作物現代產業技術協同創新中心/江蘇省作物遺傳生理重點實驗室，江蘇揚州 225009)

草害是影響作物高產、穩產、優質的重要因素之一，是當今農作物育種家主要針對的難點之一，也是苦惱廣大農民的一大問題。在水稻生產中，隨著直播稻栽培面積的不斷擴大，稻田草害越來越嚴重。噴施除草劑是防治草害的有效手段，而除草劑對常規作物同樣具有傷害性，一定程度上限制了其使用范圍，培育及推廣抗除草劑水稻品種是目前最為經濟有效的解決雜草問題的方式，對于水稻輕簡栽培、提升農業生產效益具有重要意義。

目前，在抗不同種類除草劑的作物中，只有抗草甘膦、草胺膦及抗咪唑啉酮類除草劑作物獲得大面積的種植，其中由非轉基因手段獲得的抗咪唑啉酮類除草劑作物最受人們青睞。咪唑啉酮類除草劑是農業生產上廣泛使用的一類高效廣譜低毒的除草劑，目前已有6種商業化產品，包括咪唑乙煙酸、咪草酸、咪唑煙酸、咪唑喹啉酸、甲基咪草煙和甲氧咪草煙，能有效防除1年生禾本科雜草和闊葉雜草，其機理是通過抑制植物生物合成過程中關鍵酶乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase，ALS)的活性，進一步抑制植物體內支鏈氨基酸如異亮氨酸、亮氨酸和結氨酸等的合成，進而抑制植物生長。作物對咪唑啉酮類除草劑的抗性來自基因1個或多個氨基酸變異而導致酶的結構變化，已報道的抗除草劑位點包括Ala96、Ala122、Asp376、Gly95、Gly654、Pro197、Ser627、Ser653和Trp548，不同位點突變導致了不同水平的除草劑抗性。

抗咪唑啉酮類除草劑水稻在美國早已通過誘變手段被創制并廣泛應用，如XL729、XL745、XP534及XP756等抗咪唑乙煙酸雜交水稻市場份額高達75%。近年來，我國學者也創制了一些抗咪唑啉酮類除草劑水稻新種質/品種，最早通過審定的抗除草劑水稻品種是天津市水稻研究所培育的金粳818，其攜帶抗咪唑乙煙酸基因；此外，北京大學鄧興旺團隊用EMS 誘導黃華占獲得的抗除草劑突變體潔田稻001，在2019年獲得新品種權；利用這些種質，也相繼培育出一些其他抗除草劑新品種。然而，目前江蘇抗除草劑粳稻品種非常緊缺，無法適應農業生產中的用種需求，雖然針對金粳818中攜帶的抗除草劑基因開發了若干緊密連鎖或功能性分子標記，并通過標記輔助選擇(marker-assisted selection，簡稱MAS)開展了分子育種工作，初步表明在江蘇粳稻育種中具有巨大的應用潛力，但是對于其在江蘇粳稻背景下是否會對農藝性狀、稻米品質及抗病性帶來不利影響，還未有過系統研究。

本研究通過MAS方法將金粳818中的基因導入江蘇省2個優良食味粳稻品種南粳5718和南粳505中，獲得了一系列背景與受體親本基本一致、攜帶基因的高世代回交穩定改良系，通過對改良株系進行除草劑抗性鑒定，考察其主要農藝性狀、品質性狀以及對稻瘟病、白葉枯病抗性，探討了在江蘇粳稻抗除草劑育種中的利用價值。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

供體親本為金粳818，是天津市水稻研究所育成的常規優質粳稻品種，目的基因受體親本為江蘇省推廣的優良食味粳稻品種南粳5718和南粳505。鑒定目的基因抗性的除草劑為咪唑乙煙酸。

1.2 回交改良系創制

材料創建流程見圖1，2016—2020年在揚州大學文匯路校區校內基地(119°24′53″E，32°23′21″N)和海南陵水縣揚州大學南繁基地(110°01′40″E，18°31′50″N)，以南粳5718和南粳505為母本與金粳818雜交，再分別以南粳5718和南粳505作輪回親本連續5次回交、3次自交，其間利用與緊密連鎖的分子標記RM7413對進行“前景”檢測，低世代結合田間表型篩選，BCF和BCF世代利用農業農村部頒布的農業行業標準NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術規程 SSR標記法》中推薦的48個SSR標記和左示敏等篩選獲得的用于江蘇粳稻品種鑒定的在水稻染色體上分布相對均勻的52個核心標記(其中7個為行業標準NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術規程 SSR標記法》中的標記)，共93個SSR標記進行背景檢測，獲得背景與輪回親本一致的BCF株系。

1.3 DNA提取和PCR擴增

采用CTAB法提取單株葉片DNA，接著進行PCR擴增試驗反應。體系如下：10 μL 2×MIX， 0.5 μL Forward primer(10 μmol/L)，0.5 μL Reverse primer(10 μmol/L)，2 μL DNA(100 nmol/μL)，7 μL ddHO。反應程序分為3步：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共38個循環；72 ℃ 5 min。PCR 完成后，采用 10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，電壓選擇180 V，電流為200 A，時間為2 h左右，電泳結束后進行銀染，最后封膠拍照并分析膠圖。

1.4 除草劑抗性鑒定

于2021年夏季在鎮江市京口區新民洲試驗基地(119°33′24″E、32°16′22″N)將的高世代回交改良系和相應對照品種進行直播，3次生物學重復，每個重復直播面積1.2 m左右。在3葉1心時，將咪唑啉哃類除草劑5%咪唑乙煙酸水劑(山東先達農化股份有限公司)稀釋 1 000 倍，按300 L/hm噴霧處理，于10、20 d分別調查抗性并拍照記錄，葉片全部枯萎或死亡為感，植株存活為抗。

1.5 農藝性狀和品質性狀調查

于2021年夏季在鎮江市京口區新民洲試驗基地種植的高世代回交改良系和相應對照品種，采用完全隨機區組設計，3次生物學重復，每個重復種植9行，每行50株，共450株，株行距為分別為11.1、3.00 cm。考察的基本農藝性狀和品質性狀包括株高、全生育期、有效穗數、穗粒數、結實率、千粒質量、折合產量、整精米率、堊白粒率、堊白度、直鏈淀粉含量等。

1.6 稻瘟病和白葉枯病抗性鑒定

于2021年夏季在揚州大學文匯路校區校內基地進行稻瘟病和白葉枯病抗性鑒定。穗頸瘟抗性鑒定菌株由江蘇省農業科學院植物保護研究所劉永峰研究員提供，選用2021年分離得到并經過24個近等基因系鑒定具有代表性的菌株作為鑒定用菌株，分別為2021-3、2021-43、2021-71、2021-150和2021-497，共計5個菌株。穗頸瘟的鑒定采用5個菌種的混合液接種鑒定，在水稻孕穗期每穗注射1 mL混合菌液，每個品種接種6個幼穗，接種方法和病級評價標準參考文獻[14]。白葉枯病抗性鑒定菌株PX079也是由江蘇省農業科學院植物保護研究所劉永峰研究員提供，在水稻孕穗期，采用剪葉法進行接種，用剪刀蘸取菌液，剪去劍葉葉尖約2 cm長部分，每個品系至少接種10個單株，每個單株至少接種1個劍葉，在接種后20 d調查病斑長度。

1.7 數據分析

使用Excel 2016錄入和整理數據，用SPSS 19.0軟件中的獨立樣本測驗方法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 利用分子標記輔助選擇獲得ALS627N高世代回交改良系

為了明確抗咪唑啉酮類除草劑基因在江蘇粳稻中的育種利用潛力，以金粳818作為抗咪唑啉酮類除草劑基因供體親本，分別與南粳5718和南粳505雜交，再以南粳5718和南粳505作輪回親本分別回交，從BCF開始利用標記RM7413對進行前景檢測，再結合田間農藝性狀選擇更接近輪回親本的單株繼續回交，獲得BCF世代；對前景選擇獲得的目標單株，再用93個分子標記進行背景檢測，南粳5718和南粳505這2個回交方向分別獲得遺傳背景與輪回親本一致的單株2株和1株，以及遺傳背景與輪回親本有1～2個位點雜合的單株各2株，分別收獲種植成BCF。在7個BCF群體中，分子檢測篩選出純合且遺傳背景與輪回親本一致的單株28株(南粳5718背景)和22株(南粳505背景)，部分檢測結果如圖2-A所示，條帶與金粳818一致的單株即為攜帶的純合植株，部分背景檢測結果見圖2-B。

在BCF世代繼續進行田間綜合表型篩選，最終在2個背景下各篩選獲得基本性狀與輪回親本高度相似的3個BCF穩定改良系，分別為南粳5718R-5、南粳5718R-6、南粳5718R-9和南粳505R-2、南粳505R-7、南粳505R-12，用于接下來的綜合性狀評價。

2.2 ALS627N高世代回交改良系抗咪唑乙煙酸除草劑

為了評價高世代回交改良系對咪唑啉酮類除草劑的抗性，筆者在田間對BCF世代穩定品系進行了咪唑乙煙酸除草劑噴施試驗。如圖3所示，在噴施除草劑之前，2個對照品種(南粳5718和南粳505)與改良系均生長正常；當噴施除草劑后 10 d，對照品種逐漸枯黃死亡，而不同背景下的改良系均保持生長正常；當噴施除草劑后20 d，對照品種已全部枯死，而改良系生長正常，表明2個粳稻背景下的攜帶的高世代回交改良系對咪唑啉酮類除草劑咪唑乙煙酸具有很好的抗性。

2.3 ALS627N高世代回交改良系的農藝和稻米品質性狀

為了明確引入是否會影響農藝性狀和稻米品質， 筆者考察了高世代回交改良系和相應對照品種的基本農藝性狀和品質性狀。如表1和圖4所示，總的來說，大多數改良系表現出與相應的輪回親本相似的性狀。雖然在一些性狀上某些品系和對照之間存在顯著差異，但這些性狀在不同改良系中變化并不一致。如南粳505R-2和南粳505R-7表現出比南粳505更高的結實率，而其他改良系則表現出與相應對照接近的結實率；南粳5718R-5表現出比南粳5718更高的堊白粒率，南粳505R-2表現出比南粳505更低的堊白粒率，而其他改良系則表現出與相應對照接近的堊白粒率。表明這些性狀的改變與沒有緊密聯系，意味著在江蘇粳稻中引入對水稻農藝性狀和稻米品質沒有緊密聯系的不利影響。

2.4 ALS627N高世代回交改良系對稻瘟病和白葉枯病的抗性

為了明確的引入是否會影響水稻對稻瘟病和白葉枯病的抗性，筆者對的高世代回交改良系和相應對照品種進行了抗性鑒定。如圖 5-A 所示，對照品種南粳5718和南粳505平均單穗損失率病級分別為5.6和7.3，而南粳5718背景改良系的病級在5.0～5.6之間，南粳505背景改良系的病級在7.3～7.6之間，和各自對照品種均無顯著差異。如圖5-B所示，南粳5718和南粳505的病斑長度分別為18.35、18.67 cm，回交改良系的病斑長度在17.55～18.6 cm之間，和各自對照均無顯著差異。這些結果表明在江蘇粳稻中引入不會影響其稻瘟病和白葉枯病抗性。

3 討論與結論

江蘇粳稻種植近年來逐漸向輕簡化、機械化方向發展，直播稻的面積大幅度增加，但在直播稻田里容易發生草害，尤其是雜草稻危害，已給水稻產量和品質帶來嚴重危害。目前市面上廣泛售賣和使用的除草劑雖然有很好的抑制雜草作用，但是其在消滅雜草的同時對水稻本身也帶來無法忽視的傷害，且難以清除雜草稻，這使此類除草劑的使用受到很大限制。因此，培育抗除草劑水稻品種是解決該問題的有效方式。然而，目前江蘇抗除草劑粳稻品種非常緊缺，無法適應農業生產中的用種需求。咪唑啉酮類除草劑是一類廣譜內吸性除草劑，能有效防除雜草和雜草稻，且不危害人體和牲畜，金粳818中含有抗咪唑啉酮類除草劑基因，雖然有研究表明在江蘇粳稻育種中具有巨大應用潛力， 但是對于其在江蘇粳稻背景下是否會對農藝性狀、稻米品質及抗病性帶來不利影響，還未有過深入研究。本研究結合分子標記輔助選擇將金粳818中的基因轉入江蘇省2個優良食味粳稻品種南粳5718和南粳505中，評價其在育種實踐中的應用潛力，在每個背景下分別選擇3個背景與相應受體親本一致的BCF世代回交改良系，除草劑抗性鑒定結果顯示，受體親本噴施后全部枯死，而改良系對咪唑乙煙酸表現出完全抗性，表明基因在江蘇不同粳稻背景下對除草劑咪唑乙煙酸具有很好的抗性，這與前人報道一致。

為了進一步評估基因在生產應用中是否存在負面效應，筆者詳細比較了改良系與受體品種在一些重要性狀上是否存在差異。結果發現雖然部分改良系中的個別品質性狀發生一些改變，但是這些性狀在不同改良系中的變化并不呈現一致的趨勢，表明導入基因對水稻重要經濟性狀沒有緊密聯系的不良影響。雖然筆者使用的93對分子標記(包括農業行業標準48對SSR標記)在江蘇省粳稻中有很好的鑒別能力，但密度還是有限，不能完全代表整體背景，因此，這些性狀的變化可能是由于這些改良系的背景和受體品種還有輕微差異，穗頸瘟和白葉枯病的抗性鑒定也發現高世代回交改良系的穗頸瘟和白葉枯病抗性水平與受體親本一致，表明的引入也不會影響稻瘟病和白葉枯病抗性。這些研究表明基因在培育抗除草劑水稻品種上具很高的育種利用價值，此外，本研究選擇的受體品種南粳5718是目前在江蘇水稻生產上大面積推廣種植的優良食味軟米品種，得到的抗除草劑改良系實際應用價值高，不僅有望迅速服務于農業生產，還可以作為抗除草劑育種新的供體，最終加快江蘇及其周邊地區抗除草劑粳稻品種的開發。