利用SNP標記構建漳州南部茶樹種質資源的分子身份證

王澤涵， 于文濤， 樊曉靜， 劉財國， 房婉萍， 蔡春平， 葉乃興

(1.福建農林大學園藝學院，福建福州 350002； 2.福州海關技術中心/福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建福州 350001；3.南京農業(yè)大學園藝學院，江蘇南京 210095)

茶樹[(L.) O. Kuntze]起源于中國，我國的茶樹種質資源十分豐富。福建省漳州市位于福建省南部，毗鄰廣東省，該地獨特的氣候十分適宜茶樹的生長發(fā)育，該地有大量的地方特異性茶樹種質資源。目前在漳州市南部的云霄縣、詔安縣等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)野生茶樹群落。然而近年來漳州部分地區(qū)的茶樹資源并未得到有效保護，出現(xiàn)亂砍濫伐等現(xiàn)象。本研究采集漳州市云霄縣、詔安縣2地的茶樹種質資源，構建DNA指紋圖譜和分子身份證，有利于對漳州市地方茶樹資源的鑒定和保護。

20世紀以來，DNA分子標記技術如RFLP、RAPD、SSR以及SNP等開始應用于種質資源方面的研究。分子標記技術在構建指紋圖譜和分子身份證等方面已有較多運用。SNP分子標記技術具有自動化、高通量、遺傳穩(wěn)定性高等優(yōu)點。王大莉用SNP分子標記技術對不同品種香菇進行指紋圖譜的構建。魏中艷等利用SNP技術對不同區(qū)域大豆進行DNA指紋圖譜構建，并根據(jù)大豆的特性構建分子身份證。樊曉靜等用SNP標記技術并同茶樹種質基本信息結合，構建了103份茶樹種質資源的分子身份證。此前筆者所在課題組已對漳州南部特色茶樹種質進行了報道，但關于該地區(qū)茶樹種質資源分子身份證的構建未見相關研究。本研究利用SNP標記及茶樹種質的基本信息對74份茶樹種質資源進行指紋圖譜和分子身份證的構建，旨在為該地區(qū)茶葉地方種質的保護、利用、開發(fā)和后續(xù)的選育等工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料共74份，于2020年11月分別采自福建省漳州市的云霄縣南烏山、烏山、大帽山、小帽山、梁山、雞籠山和詔安縣秀篆鎮(zhèn)寨坪村和龍傘山。其中，云霄縣茶樹種質61份，詔安縣茶樹種質13份。茶樹品種的基本信息見表1。茶樹鮮葉放入 -80 ℃ 冰箱冷凍保存。

表1 漳州南部74份茶樹種質基本信息

1.2 樣品DNA的提取

茶樹DNA樣品的提取和濃度檢測詳見樊曉靜等的方法。

1.3 SNP位點的挖掘和最佳SNP位點的篩選

本研究所用的茶樹SNP位點共24個，詳細的選用見樊曉靜等的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用GenAlEx6.503軟件進行位點多態(tài)性分析。利用數(shù)據(jù)分析軟件進行數(shù)據(jù)篩選和分析，確定每個SNP位點處的樣品基因型。將茶樹的基本信息與其24個SNP位點信息相結合，并用條碼生成器和二維碼在線生成軟件以數(shù)字條形碼和二維碼的形式構建茶樹種質分子身份證。

2 結果與分析

2.1 福建漳州南部茶樹種質資源SNP標記多態(tài)性描述

通過對96個位點的篩選，獲得78個多態(tài)性強、適用于福建漳州南部茶樹種質基因分型的特異性引物。78個SNP標記多態(tài)性信息指數(shù)為0.040～0.693，平均值為0.426。觀測雜合度范圍為0.014～1.000，平均值為0.345。期望雜合度的范圍為0.013～0.500，平均值為0.276。固定指數(shù)為 -1.000～0.660，平均值為-0.114。次等位基因頻率范圍為0.047～0.541，平均值為0.219(表2)。

2.2 福建漳州南部茶樹種質資源指紋圖譜的構建

通過SNP數(shù)據(jù)分析軟件，可以得出每個SNP位點上每個茶樹種質是純合子(XX，YY)或雜合子(XY)。筆者所在課題組前期從96個SNP位點中篩選出了24個多態(tài)性較高的位點，74份茶樹種質的位點信息見表2，構建的指紋圖譜見圖1。

表2 漳州南部茶樹種質資源78個SNP標記多態(tài)信息

2.3 福建漳州南部茶樹種質資源分子身份證的構建

茶樹的分子身份證由28位數(shù)字組成，其中前4位數(shù)字是茶樹的基本信息，后24位是茶樹的位點信息(表3)。筆者所在課題組前期已根據(jù)茶組植物的分類、產(chǎn)地信息和茶樹種質資源的類型進行了種植資源信息編碼的構建。如云霄云香茶，它屬于茶組植物中的茶樹()，編碼為1；原產(chǎn)地為福建，編碼為35；茶樹種質資源類型為地方種質，編碼為2，因此他的基本信息編碼為1352。共有24種基因型，3種等位基因(XY、XX和YY)，每個位點分別用1～3代表等位基因的多態(tài)性。以云霄云香茶為例，其24個SNP分子標記的基因型分別為TT、CC、AA、CT、AG、GG、TC、CC、TT、TT、TT、AG、AG、GG、TT、AG、TT、TC、TC、TT、CG、AA、CC、TC，轉換成24位數(shù)字為222112132221123131131331。因此小帽山云香茶的分子身份證為135222211213222112 3131131331。云霄云香茶的身份證信息及其轉化的條碼和二維碼見圖2。

表3 福建漳州南部茶樹種質資源的分子身份證

3 討論與結論

分子身份證的構建逐漸趨向于數(shù)字化。陸徐忠等用SSR技術將商品信息與標記信息相結合構建了水稻的分子身份證，并制作了相應的條形碼信息。陳小紅等用SSR技術，根據(jù)電泳條帶有無賦值1/0，形成0/1字符串的編碼方式構建黍稷種質的身份證。上述方法所構建的品種身份證形式簡潔，容易用電子產(chǎn)品等識別。但他們所使用的SSR標記多為隨機標記，無法與樣品表型性狀相聯(lián)系。相對于上述技術，SNP標記技術具有針對性強，來源豐富等優(yōu)勢。張昆鵬用SSR標記和SNP標記構建不同油菜品種的指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)SNP技術計算的遺傳系數(shù)更精準可靠。Jones等為了對SSR標記和SNP標記進行比較，以不同品系的玉米作為試驗材料進行比較分析，結果表明SNP的可重復性較SSR更高。通過前人的研究可以發(fā)現(xiàn)SNP標記具有較高的準確性和重復性，這些優(yōu)點為指紋圖譜和分子身份證的構建奠定了一定的基礎。因此本研究基于SNP技術對福建漳州南部的茶樹種質資源進行指紋圖譜和分子身份證的構建。

分子身份證可以更加簡單明了地進行種質資源的鑒定。本研究構建了74份茶樹種質的分子身份證，包含二維碼信息和條形碼信息，每份茶樹品種獨有且號碼唯一。基于茶樹的身份證號，本研究構建了條形碼和二維碼，條形碼可以被電子設備快速掃描識別，二維碼則可以容納大量的圖片和數(shù)字信息。這些技術的使用在漳州南部茶樹種質資源的鑒定和保護中發(fā)揮重要的作用。SNP位點選用的越少，品種的成本就會越低，筆者所在課題組前期篩選出最佳的24個SNP位點可以有效鑒別茶樹種質資源。本研究利用這24個SNP位點對來自福建漳州南部的74份茶樹種質資源進行指紋圖譜和分子身份證的構建。目前，把條形碼和二維碼技術應用于分子身份證構建的研究較少，郭艷春等利用SSR技術構建了黃麻種質的分子身份證。樊曉靜等利用SNP技術構建了茶樹的分子身份證。本研究利用SNP技術首次構建了福建漳州南部74份茶樹種質資源的分子身份證，這為福建漳州茶樹種質資源的區(qū)分、保護和合理開發(fā)選育提供了新思路。

致謝：本研究試驗樣品采集承蒙云霄縣茶葉科學研究所王彩云、方德音、蔡捷英、王金煥等老師，漳州仙隱峰茶葉有限公司張木山總經(jīng)理，福建省顧恒生態(tài)農業(yè)發(fā)展有限公司張英豪總經(jīng)理， 福建省元勛生態(tài)科技有限公司王元勛董事長的支持和幫助，特此致謝！