西瓜枯萎病抗性分子標記篩選與應用

劉 廣， 黃曉云， 徐錦華， 張 曼， 姚協豐， 婁麗娜， 徐 建， 侯 茜， 朱凌麗， 羊杏平

(1.江蘇省農業科學院蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇南京 210014；2.蘇州農業職業技術學院環境工程學院，江蘇蘇州 215008)

西瓜枯萎病，別稱萎蔫病、死藤病、枯苗病，是由于西瓜的特異?；筒【怄哏牭毒?f. sp.)入侵根部感染而引起的可發生在西瓜植株整個生長期的病害，尤其是在西瓜膨大期更易發生，表現為早期植株出現類似失水的癥狀，葉子有點萎蔫，慢慢地整株枯死?？菸ξ鞴袭a量的影響很大，會導致減產甚至絕收，給農民帶來極大的經濟損失。因此西瓜不能在同一地塊連作。但是由于土地資源的貧乏及溫室、大棚等保護地設施的大面積應用，枯萎病發生日益嚴重，而針對枯萎病選育抗性強的西瓜新品種是解決這一難題最環保有效的措施之一。

一般采用枯萎病接種及田間檢測的方法來鑒定西瓜品種的抗性，耗時長且需要大量的人力、物力。分子標記是一種可以連續遺傳且在后代中能檢測到的DNA序列，可以反映植株個體之間或群體之間基因組差異的特異性DNA片段，已成功應用于作物的抗性輔助選擇、指紋圖譜構建、純度檢測等方面。本研究利用西瓜遺傳群體篩選與西瓜枯萎病抗性基因緊密連鎖的分子標記，并將篩選得到的分子標記應用于西瓜材料的枯萎病抗性選擇，從而得到抗性好的西瓜材料，用于后期的育種工作，這對于西瓜的抗性育種具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

用1個雜交后代的抗感單株群體以及20個西瓜材料作為本次的試驗材料。伊選作為母本，高感枯萎病生理小種1；sugarlee作為父本，高抗枯萎病生理小種1，2017年春季雜交后獲得F，2017年秋季進行自交后，獲得49個單株F群體，2018年春季進一步自交后，獲得F家系。20個西瓜材料及來源見表1。試驗材料種植于江蘇省農業科學院六合試驗基地塑料大棚中。

表1 西瓜材料及來源

1.2 試驗方法

1.2.1 苗期人工接種枯萎病病菌的抗性鑒定 利用尖孢鐮刀菌西瓜專門型生理小種1對西瓜幼苗進行人工接種鑒定。參照吉加兵的方法進行接種。當西瓜幼苗培養到2葉1心時，取葉片用于DNA提取，然后用配制好的孢子懸浮液(孢子濃度為5×10個/mL)進行根部接種。接種后保持環境溫度為18～26 ℃。約1周后開始發病，間隔2 d調查發病率以及病情指數。隨機提取病樣，分離病原物并進行培養，用顯微鏡觀察病原。癥狀的分類基于Martyn的標準，高感(HS)病株率為81%～100%，感病(S)病株率為61%～80%，中抗(MR)病株率為41%～60%，抗病(R)病株率為21%～40%，高抗(HR)病株率為0～20%。其中感病型包括S和HS，病株率在61%及以上；抗病型包括HR、R、MR，病株率在60%及以下。感病對照(Sugar Baby)、中抗對照(Charleston Gray)、高抗對照(Calhoun Gray)來自美國，均由筆者所在實驗室繁育。

1.2.2 基因組DNA的提取 當西瓜品種生長到2葉1心時，取幼嫩西瓜葉片1.5～3.5 g，利用液氮快速磨成粉末，加入十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)裂解液，65 ℃水浴0.5～1.0 h，冷卻后加入同等體積的三氯甲烷與異戊醇的混合物(體積比為 24 ∶1)，輕輕搖晃25 min左右，在 12 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液，抽提1～2次，然后加入10%醋酸鈉和預冷的異丙醇，在4 ℃冰箱中靜置3 h以上，收集的絮狀DNA用70%乙醇進行洗滌，干燥后溶解于TE緩沖液中，4 ℃保存備用。

1.2.3 引物合成 參考國內外與西瓜枯萎病抗性相關的文獻，合成22個/對引物，其中2對切割擴增多態性序列(CAPS)引物，6對插入/缺失(InDel)引物，5對序列特征擴增區(SCAR)引物，2對衍生切割擴增多態性序列(dCAPS)引物，7個隨機擴增多態性DNA(RAPD)引物(表2)。

表2 22個與西瓜枯萎病抗性基因相關的引物

1.2.4 PCR擴增與產物檢測 隨機擴增多態性DNA聚合酶鏈式反應(RAPD-PCR)的體系為 25 μL，其中引物2 μL，DNA 2 μL，ddHO 8 μL，Mix buffer 13 μL。PCR擴增程序為 94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，37 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，40個循環；72 ℃ 10 min。擴增樣品在1.0%的瓊脂糖凝膠中(加入10% GoldView)進行檢測。InDel/SCAR/CAPS/dCAPS-PCR反應體系為25 μL，其中包含DNA 1 μL，上游引物1.25 μL，下游引物 1.25 μL，ddHO 8.5 μL，Mix buffer 13 μL。PCR擴增過程為94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共36個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。CAPS/dCAPS產物的酶切反應體系為15 μL：10×buffer 1.5 μL，限制內切酶Ⅰ(來源于Thermo Fisher Scientific公司)0.5 μL， PCR產物5 μL， ddHO 8.0 μL。65 ℃保持12 h，80 ℃保持20 h進行酶切反應，反應產物于4 ℃保存。擴增樣品采用8.0%聚丙烯酰胺凝膠電泳，在120 V恒壓條件下電泳 1～2 h，銀染染色。

1.2.5 數據分析 通過Joinmap 4.0軟件進行枯萎病抗性性狀連鎖的遺傳分析。

2 結果與分析

2.1 西瓜父母本、F1、F2三世代對枯萎病生理小種1的抗病性鑒定

表3 西瓜群體對枯萎病生理小種1的抗性鑒定結果

2.2 西瓜枯萎病生理小種1抗性基因Fon1標記的定位分析

根據伊選×sugarlee F群體苗期枯萎病生理小種1的抗病性檢測結果，從F單株中取檢測結果表型為抗病性及表型為感病性的單株各5個， 利用它們的基因組DNA進行混合構建抗、感基因池。利用集團混合分析(BSA)法對 22個CAPS、dCAPS、InDel、RAPD、SCAR分子標記進行多態性篩選，發現3個與西瓜抗性基因緊密連鎖的分子標記(indel04、indel05、indel06)。分子標記indel04產生了1個210 bp與西瓜枯萎病抗性基因相連鎖的特異標記indel04210；分子標記indel05產生了1個225 bp與西瓜枯萎病抗性基因相連鎖的特異標記indel05225；分子標記indel06產生了1個365 bp與西瓜枯萎病抗性基因相連鎖的特異標記indel06365(圖1)。

然后利用 Joinmap 4.0 軟件對F代群體的單株進行研究，通過對 49個F代分離群體單株的抗感表型和分子基因型進行分析，發現indel04、indel05、indel06這 3個分子標記位于的一側，連鎖距離分別為 7.5、10.7、13.7 cM(圖2)。

2.3 西瓜枯萎病抗性分子標記在種質資源中的鑒定

利用篩選得到的與西瓜枯萎病抗性基因緊密連鎖的indel04、indel05、indel06等3個分子標記對20份西瓜材料進行分子檢測(圖3)。這20份西瓜材料的抗性性狀已經通過苗期接種鑒定確定其西瓜枯萎病抗感性，共有9個抗枯萎病的品種和11個感枯萎病的品種。試驗結果顯示，indel04、indel05、indel06與苗期接種鑒定結果的符合率分別為85%、90%、90%(圖3，表4)。說明indel04、indel05、indel06這3個分子標記可以應用于西瓜材料針對枯萎病生理小種1的抗性鑒定，對西瓜的抗性育種具有重要作用。

表4 20個西瓜材料接種鑒定與分子鑒定結果

3 討論

枯萎病是西瓜栽培中的一種災難性土傳真菌病害， 嚴重影響了西瓜的產量和品質。 選育抗枯萎病的西瓜新品種是解決這一生產難題的有效措施。傳統的抗性品種篩選耗時費力，開發利用與西瓜枯萎病抗性基因相連鎖的分子標記進行輔助選擇，可有效提升育種時效，推進抗性育種的進程，對我國重茬嚴重的保護地栽培具有重要意義。

為了攻克這一難題，國內外科研人員在西瓜抗枯萎病分子標記的輔助育種中做了大量工作，獲得了一些與西瓜枯萎病抗性性狀緊密連鎖的分子標記，但是由于遺傳群體不同，標記類型不同，有的標記重復性不佳，不能應用于西瓜品種的抗性育種輔助選擇。本研究以父本sugarlee、母本伊選、F代、F代及F代為試驗材料，研究了父本sugarlee對西瓜枯萎病的抗性遺傳規律，并在前人研究的基礎上，利用已發表的22個/對引物對遺傳群體親本及抗感池進行了分析， 篩選得到3個與西瓜枯萎病抗性基因緊密連鎖的分子標記(indel04、indel05、indel06)，并利用這3個標記對20份西瓜材料進行了分子檢測，與苗期枯萎病抗性鑒定結果基本一致，可應用于之后的西瓜抗性育種輔助選擇，對推進西瓜的抗性育種進程及西瓜產業的優質高效發展具有重要意義。