利用CRISPR/Cas9系統編輯銀腺楊84K LAZY基因

楊海峰， 甘曉雪， 薄高峰， 王佳琪， 郝 璞， 張富滿， 王文功， 韓傲霜

(內蒙古農業大學林學院，內蒙古呼和浩特 010018)

分枝角度是形成理想株型的重要組成部分，對植物的生物量、經濟林木的產量、固碳量、景觀效果均具有重要影響。分枝角度的大小受基因、內源激素以及外界環境等多種因素調控，其中，基因調控是重要的內部因素。研究發現，基因家族對分枝角度的調控尤為顯著，隸屬于基因家族的基因，最早由Takahashi等發現并確認其與分枝角度具有相關性，經Kishimoto等研究確定水稻中的基因位于11號染色體近著絲點位置，在pd56和M265之間的68 kb區域中。隨著對基因的進一步深入研究，多位科學家先后從水稻()、高粱()、小麥()、玉米()、擬南芥()等植物中發現了基因的同源基因，從而證明了基因并不是單子葉植物所特有的。2017年，Xu 等以窄冠白楊為材料，分析了1基因在不同組織部位的表達情況，發現1基因在莖中最多，腋芽、葉中次之，根中表達量最少，這與Overbeek對玉米突變體的研究結果相一致，由此證明基因主要參與了植株地上部分的負向地性重力反應。

CRISPR/Cas9技術通過小向導RNA(sgRNA)介導和Cas9 蛋白切割實現對靶基因的編輯(堿基插入、刪除、替換等)，從而實現基因敲除。因其具有簡便、高效、低價等優點，被廣泛應用于水稻、小麥、擬南芥、煙草()、毛白楊()等植物的研究中；其中，在水稻、小麥、擬南芥中都獲得了穩定的基因編輯突變體，為植物基因功能研究和遺傳改良做出杰出貢獻。但目前為止，大部分研究僅是對特定位點的突變，在目標基因上精準編輯的效率很低。近年來，有多位科學家在玉米、大豆[(Linn.) Merr.]、水稻、擬南芥中嘗試了同源基因的精準編輯。例如，Svitashev等成功通過基因槍轉化法對米未成熟胚中的、等基因進行精準編輯。Zhao 等利用雙元RNA向導的 CRISPR/Cas9 系統對基因的一個特定區段進行了定點替換。因此，開發出高效、精準的CRISPR/Cas9基因編輯技術將是現代基因組學靶向修飾工作的巨大進步，且具有廣闊的應用前景。

本研究以銀腺楊84K為研究材料，從中克隆獲得、、基因的基因組部分序列，設計靶點，構建基因編輯載體，轉化84K楊，獲得轉基因株系，以期為分析基因功能提供研究材料，奠定研究基礎，為深入研究CRISPR/Cas9系統在木本植物中的應用和技術改良提供線索，為楊樹分子育種及品種改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

銀腺楊84K(×84K)無菌苗，由內蒙古農業大學林木遺傳育種教研室保存；pEn-Chimera入門載體和pDE-CAS9-NPTⅡ表達載體質粒由美國農業部林務局西南太平洋工作站林木遺傳所贈送；大腸桿菌DH5α感受態細胞和農桿菌GV3101感受態細胞，由筆者所在實驗室制備。

1.2 LAZY1基因克隆及靶點設計

使用BioEdit軟件，以銀腺楊84K的全基因組DNA數據庫創建本地數據庫，以沙柳、、基因的蛋白質編碼區(CDS)序列分別作為查詢序列，進行本地BLAST搜尋，獲得3個同源基因序列，分別命名為、、。根據這3個同源基因的序列設計上下游引物，預期產物長度分別為1 836、2 074、1 374 bp。試驗用到的引物序列詳見表1。

表1 本研究所用引物

采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取野生84K楊基因組DNA為模板，利用-F和-R、-F和-R、-F和-R分別為引物，進行PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切膠回收后與pMD 19-T載體連接并測序獲得84K楊中、、基因在2條同源染色體上的序列。

利用銀腺楊84K基因組數據庫及克隆獲得的完整序列信息，將、、基因的第1個外顯子序列分別在基因編輯靶點在線設計網站(https：//zlab.bio/guide-design-resources)上設計、篩選出得分最高的靶點序列，將靶點正向序列5′端添加ATTG堿基，靶點的反向互補序列5′端添加AAAC堿基，送至中美泰和生物技術(北京)有限公司合成引物。

1.3 LAZY基因敲除載體構建

對pEn-Chimera入門載體質粒進行酶切，回收酶切產物，獲得線性化pEn-Chimera入門載體。采用重組PCR的方法將添加接頭的2條靶點序列進行雙鏈互補，并與線性化pEn-Chimera載體連接，轉化DH5α大腸桿菌，測序鑒定。將構建成功的入門載體pEn-Chimera和表達載體pDE-CAS9-NPTⅡ進行同源置換，轉化DH5α大腸桿菌，對菌落進行PCR鑒定，并測序檢測。將成功構建的表達載體轉化農桿菌GV3101菌株。

1.4 銀腺楊84K葉盤法轉化及轉基因植株的檢測

活化攜帶有表達載體的農桿菌菌株，振蕩培養至吸光度為0.6～0.8時，重懸菌液，用于侵染。取培養3～4周無菌苗中上部葉片，垂直葉脈劃傷，置于重懸液中，50 r/min振蕩侵染15 min。將葉片置于共培養基上，暗培養3 d。轉移至分化培養基上光照培養，2～3周繼代1次。待葉片長出愈傷組織并分化出芽，芽高2～3 cm時，切下置于生根培養基中培養2～3周即可生根，同時利用生根培養基進行單株增殖擴繁。對獲得的抗性株系分別提取DNA，以SS61引物和靶點反向序列為引物進行PCR擴增，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，篩選陽性植株。

1.5 基因編輯效率的檢測

以轉基因株系DNA為模板，加入引物-F和-R進行PCR序列擴增，獲得目標產物經切膠回收后與pMD 19-T載體連接，轉化DH5α大腸桿菌，對菌落進行PCR鑒定，并測序檢測。利用DNAMAN(Version 7.0)對測序結果與靶點序列進行比對，分析編輯效率。

2 結果與分析

2.1 LAZY-1基因組序列的克隆與靶點設計

利用銀腺楊84K的基因組數據庫結合沙柳、、基因的CDS序列，經比對獲得3個基因的同源序列，分別命名為、、。以野生型84K楊的DNA為模板，-F和-R、-F和-R、-F和-R 分別為上下游引物，克隆獲得、、基因組部分同源序列，該序列為包含上述基因前2個外顯子完整序列的基因組序列。

將上述3個基因的第1個外顯子序列分別在基因編輯靶點在線設計網站(https：//zlab.bio/guide-design-resources)上提交設計；獲得3個高分靶點序列(圖1)。該靶點序列在目標基因上無單核苷酸多態性(SNP)位點，GC含量為40%，前間隔序列鄰近基序(PAM)標識位點為NGG(N可以是A、T、G、C中的任意堿基)，與楊樹中同源關系較近的基因同源序列比對結果顯示，錯配堿基數為3～4個，說明該靶位點特異性較高，符合敲除靶點的設計要求。

2.2 LAZY1基因編輯載體構建

將互補雙鏈的靶點序列連接線性化的pEn-Chimera入門載體，經PCR鑒定，目標條帶與預計的369 bp目標片段長度一致(圖2-a)。測序結果表明，、、靶點序列成功進入 pEn-Chimera 入門載體，可進行下一步表達載體構建。

將攜帶有基因靶點序列的pEn-Chimera入門載體與pDE-CAS9-NPTⅡ表達載體進行同源置換，PCR鑒定結果表明，目標條帶與預計的 933 bp 目標片段長度一致(圖2-b)。測序分析結果表明，靶點序列及其驅動元件已成功置換進 pDE-CAS9-NPTⅡ 表達載體中，可用于銀腺楊84K的基因轉化。

2.3 轉基因株系獲得及PCR鑒定

將構建的3個基因編輯表達載體(：：、：：、：：)，通過農桿菌介導法轉化84K楊，分別獲得21、17、12株抗性株系(圖3)。為檢測單基因編輯的轉化效率，本研究對轉化：：載體的21株抗性植株進行PCR鑒定，檢測結果表明，共13個株系為陽性植株，PCR陽性鑒定陽性率為61.9%(圖4)。

2.4 轉基因植株靶點序列編輯效率分析

對的13個轉基因株系進行靶點序列測序分析，結果表明，在1號、5號、9號株系中均發生不同程度的堿基缺失，其中1號株系靶點的第16、17個堿基發生缺失，5號株系靶點的第15個堿基發生缺失，9號株系靶點的第18個堿基發生插入，靶點編輯效率為23.07%，均為雜合突變體(表2)。

表2 PagLAZY1a基因編輯株系的靶標位點序列分析

3 討論

植物分枝角度和分枝方向在植物形態建成過程中具有重要作用，與植物生物量和作物產量密切相關。其中，有關分枝角度調控的分子層面研究目前仍以高粱、水稻、小麥等草本模式植物為主，在木本植物中的研究相對較少，尚缺乏系統性研究。本研究利用CRISPR/Cas9系統對銀腺楊84K分枝角度相關基因基因進行敲除，獲得抗性植株，檢測靶標位點，分析編輯效率，旨在為后續基因家族在楊樹中的基因功能研究提供基礎參考數據。

CRISPR/Cas系統是近年來發展起來的能夠實現對基因組精準定點編輯的技術，相對于其他基因編輯技術效率更顯著，操作更便捷，但在某些植物中編輯效率較低。本研究按照sgRNA的設計原則，設計基因靶標序列，長度均為20 nt，轉化銀腺楊84K后對陽性植株進行靶標序列檢測，發現靶點編輯效率僅為23.07%，效率較低，可能存在2個方面的原因。首先，靶標序列的長度對編輯效率有影響。據Fu等的研究顯示，采用小于20 nt的短sgRNA進行基因打靶試驗，可以有效降低脫靶風險，提高編輯效率。Chen等比較不同長度(18、19、20個堿基) sgRNA的切割效率，發現長度為 19 個堿基的sgRNA具有最高的切割效率。其次，選用合適的啟動子能夠有效提升CRISPR/Cas9系統的基因編輯效率。本研究利用來自擬南芥的AtU6-26啟動子構建表達載體，雖然成功獲得基因編輯成功株系，表明該啟動子可應用于銀腺楊84K的CRISPR/Cas9系統研究，但編輯效率較低，可能有啟動子的影響。因此，在后續基因編輯工作中，將采用19 nt靶點序列，同時采用來自84K楊的啟動子來構建基因編輯載體，預計能夠有效提高基因編輯效率。

4 結論

本研究利用銀腺楊84K為材料，成功構建了3個同源基因的基因編輯表達載體，獲得13株轉化：：載體的陽性株系，其中3個株系基因編輯成功，編輯效率為23.07%。該研究結果可以為基因功能的研究和楊樹分子育種提供理論依據，為CRISPR/Cas9系統在銀腺楊84K中的應用做了初步探索，同時，為改良CRISPR/Cas9系統提供了參考。