黃瓜誘變育種研究進展

陸 珂， 吳則東， 李勝男

(黑龍江大學現代農業與生態環境學院/黑龍江省普通高校甜菜遺傳育種重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150080)

黃瓜(L.)是葫蘆科甜瓜屬的二倍體物種，也是世界主要蔬菜作物之一。黃瓜由于其清香脆甜的口感，深受人們的喜愛，是我國設施農業產量最高的蔬菜之一，一直是人們餐桌上的主要蔬菜。中國的黃瓜栽培歷史悠久，面積廣泛，2020年收獲面積為128.02萬hm，年產量達7.283×10t，占世界總量的56.61%和79.81%。盡管黃瓜的栽培面積和產量都很大，但是與葫蘆科的其他作物相比，它的基因組只有 367 Mbp，相對較小，遺傳基礎較狹窄，自然變異頻率低，變異率僅有3%～8%。經過長期的自然和人工選育，黃瓜品種間的遺傳差異越來越小，遺傳多樣性不足。依靠黃瓜的自發突變獲得優良的遺傳材料，已無法滿足黃瓜功能基因組學研究的需要，導致黃瓜遺傳育種進程緩慢。面對這樣的困難和瓶頸，開發新技術，人為地創造優質突變體，構建優異的種質資源，加快黃瓜育種的進程已成必然。

誘變育種技術是指利用不同的物理或化學因素，人為地使植物體的組織發生變異，再通過選擇，育成抗性強、產量高的新品種。誘變能引發基因突變，相比常規育種具有提高變異頻率、擴大選擇譜、產生有益突變的優點，還能打破原有基因的連鎖，促進遺傳重組，從而能在短時間內獲得豐富突變體以育成新品種。目前在黃瓜誘變育種的研究領域中，國內外學者主要通過物理誘變、化學誘變的方法，使黃瓜產生大量的遺傳變異，促進黃瓜功能基因組學的研究。

本研究基于國內外學者對黃瓜的誘變育種的研究，對黃瓜突變體庫構建的方法進行歸納總結，包括物理誘變、化學誘變、航天誘變及插入突變的方法，并探討了誘變技術對黃瓜性狀的影響以及鑒定方法，論述了黃瓜突變體在黃瓜育種進程中的應用，為黃瓜重要功能基因的挖掘以及新品種的選育奠定基礎，提供重要的理論參考與借鑒。

1 黃瓜突變體庫的構建方法

1.1 化學誘變

化學誘變是指利用各種化學誘變劑使植物材料的遺傳物質發生變異，通過選擇，對突變體進行培育，選育成新品種的方法。化學誘變由于高效、使用方法簡便并且成本較低，現如今被廣泛使用。化學誘變劑是指能夠對植物體材料的遺傳物質產生作用，使其產生變異的化學物質。目前，常用的化學誘變劑有四大類：

(1)烷化機類，該類化學誘變劑使誘變劑內一至多個活性烷基，通過烷化作用的方式，置換DNA分子結構中的氫離子，從而導致復制或轉錄過程中DNA發生改變，進而產生變異。常用的代表試劑有甲基磺酸乙酯(EMS)、乙烯亞胺(EI)、硫酸二乙酯(DES)等。

(2)核酸堿基類似物，因其具有與DNA堿基相似的化學結構，在復制時能與DNA結合。在DNA復制的過程中進入DNA結構中充當堿基，從而形成異種DNA，進而導致堿基在配對時不按互補配對的原則配對，發生錯配，從而引起點突變。代表試劑有5-溴尿嘧啶(5-Bu)、5-氟尿嘧啶、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-BudR)等。

(3)疊氮化鈉(NaN)，是一種點突變劑，它可使正在進行復制的DNA堿基發生替換，從而形成點突變。NaN具有高效安全、無毒、成本較低的特點。

(4)其他化學誘變劑，如抗菌素、亞硝酸、羥胺等，雖然也能引起基因結構突變，但在誘變育種中使用價值較低。

其中，EMS以其簡單方便、誘變頻率高的特點，在黃瓜突變體庫的構建中應用較多。EMS誘變首先發生在DNA鳥嘌呤的N-7位置上，烷基取代氫離子后，成為一個帶正電荷的季銨基團，烷化的鳥嘌呤與胸腺嘧啶配對，代替胞嘧啶，發生轉換型的突變，從而使GC堿基對變異為AT堿基對，EMS誘變遺傳物質核酸有99%的概率是這種情況(圖1)，可能產生無義突變、錯義突變和沉默突變，這3種突變發生的頻率對突變體的篩選具有一定的指導意義。何書強利用1.6%EMS誘導華南型黃瓜高代自交系32X時間12 h，篩選出64種變異表型，包括植株矮化、3張子葉、真葉白化等典型突變體，其總變異率為28.19%。羅琳等利用0.5%、1.0%、2.0% EMS分別處理新泰密刺黃瓜，通過M0、M1代的比較分析，發現種子發芽率隨EMS濃度的升高而下降，子葉葉面積和子葉葉綠素含量與對照相比明顯下降，然而真葉葉綠素含量顯著上升，分別比對照提高11.92%、19.13%、15.53%。

1.2 物理誘變

物理誘變是指利用各種理化因素使植物材料的基因結構發生變異，通過選擇優良單株，進而對其進行培育，選育成新品種的方法。典型的物理誘變劑是不同種類的射線，主要的射線有X射線、射線、射線、射線、紫外線、離子束等。

我國對于輻射誘變育種的研究最早開始于1957年，隨著我國科技高速發展，輻射誘變的發展也非常迅速，如今已廣泛應用于植物遺傳育種，其中，X射線和射線的應用非常廣泛。其原理是電離輻射與植物體內分子、原子核發生碰撞，直接或間接引起植物體內DNA結構發生變異，或者使遺傳物質DNA斷裂再修復，導致染色體產生斷裂、重排、缺失、倒位等變異，從而引起基因突變。蔡世娟等利用C輻射對自交系黃瓜18C-1進行輻射誘變試驗，低劑量(60 Gy)輻射減弱幼苗的光合作用和抗逆性，中、高劑量(80～120 Gy)輻射增強幼苗光合作用和抗逆性，C輻射對黃瓜光合色素各組分含量和光合基因表達量均產生影響。Palma等利用單色藍光、綠光、紅光和寬帶白光聯合紫外線輻射對黃瓜Lausanna RZ F種子進行處理，發現紫外線輻射通過基因依賴的方式來抵抗藍、紅、綠、白光對轉錄物積累的影響。胡尊瑞等利用冷等離子體模擬真空狀態處理黃瓜玉璽一號種子，發現最佳處理功率是80 W，種子的發芽勢、發芽率均有提高，并且可以促進黃瓜種子生根發芽，提早開花結實。但由于物理和化學誘變產生的突變密度較高，包含多個突變位點，往往需要構建突變表型分離群體，利用圖位克隆、定向誘導基因組局部突變技術(TILLING)等精確的篩選技術來篩選突變位點，確定突變基因。

1.3 太空誘變育種

太空誘變育種，又稱太空育種、航天育種，是指通過返回式衛星搭載植物種子或其他植物組織材料，利用太空環境中微重力、宇宙射線、高真空和交變磁場等物理因子，誘變植物材料發生變異，返回后通過栽培，從后代選擇優良單株，進而對其進行培育，選育成新品種的方法。西部航天育種基地和甘肅省天水市農業科學院研究所通過航天搭載，選育出了優良變異白黃瓜品系05-33-6-1-2-49。潘連公等通過對航遺1號黃瓜進行分子生物學分析，發現航天誘變后的黃瓜種子變異豐富、穩定快，發生了產量提高、口感好及耐儲存等有益變異。

1.4 插入突變

插入突變是指在植物基因組中隨機插入 T-DNA、轉座子和逆轉錄轉座子等已知序列的元件，使其能夠影響或破環原有的基因結構，從而抑制插入位點基因功能的正常表達來創制突變體。T-DNA 插入通常為1～2個拷貝插入，雖然在受體基因組中的整合位置是隨機的，但插入位點的側翼序列是唯一的，不會在基因組整合后發生轉座，具有高效表達和穩定遺傳的特點。因此，T-DNA 常被用作插入誘變劑來分離和克隆因插入而失活突變的基因。隨著農桿菌介導的遺傳轉化技術愈發成熟，T-DNA插入突變技術廣泛應用于擬南芥和水稻突變體庫的構建。

1986年，Trulson等首次利用農桿菌介導的遺傳轉化技術得到黃瓜轉基因材料，在過去的幾十年里，國內外學者對黃瓜遺傳轉化體系做了大量研究，為T-DNA插入突變技術在黃瓜功能基因組學的應用奠定基礎。馮路路等利用基因作為黃瓜長春密刺T-DNA插入片段創制突變體，并通過熒光顯微鏡與TAIL-PCR技術最終確定插入位點。李蕾等以黃瓜長春密刺為植物材料，采用農桿菌介導法，利用T-DNA插入突變體構建轉化植株，并采用PCR和斑點雜交檢測的方法得到插入突變體14S1。但目前黃瓜遺傳轉化體系仍然存在效率低和遺傳穩定性差的問題，從而影響黃瓜 T-DNA 插入突變體的獲得。

2 誘變技術對黃瓜性狀的影響

2.1 表型性狀的影響

通過物理和化學等技術誘導使黃瓜部分基因發生突變，有許多突變性狀會直接表現在表型上。薛存寶利用1.5%和2.0%EMS誘變歐洲溫室型黃瓜649品系，發現有64個表型有變化的突變體單株，突變頻率為15.2%，其突變性狀有矮化、短瓜、無花、葉緣失綠、葉片皺縮等。齊曉花等利用EMS誘導華北類型黃瓜YZ-01品系，得到了植株矮化、皺縮、圓葉、花瓣和花萼連體、少果刺等突變性狀(圖2)。Qian等利用UV-A和UV-B 2種紫外線輻射對黃瓜Hi Jack進行輻照，發現UV-A的輻射可以使植株株型更加矮小、強壯。因此，表型鑒定是篩選差異性狀突變體最直觀的方法，可以利用表型突變的優勢，豐富突變體庫，從而為黃瓜基因功能分析和新品種的選育奠定基礎。

2.2 生理生化的影響

不同的誘變技術不僅對黃瓜有表型性狀上的影響，在生理生化方面也會表現出與野生種不同的性狀。陳玉霞等利用Co-γ射線輻照黃瓜新品種新津春4號干種子，發現當輻射劑量為100～1 000 Gy 時，輻射處理對種子萌發和幼苗生長抑制明顯，并且黃瓜種子輻射誘變的半致死劑量是 795 Gy。Volkova等利用50、100、150、200 Gy劑量的Co-γ射線輻照黃瓜種子，發現50 Gy的低劑量輻射對黃瓜第4天的發芽狀況和苗長影響最明顯，所以低劑量的Co-γ輻射能提高黃瓜種子早期的發芽率和幼苗生長。Liu等利用不同劑量的紫外線輻射UV-B對黃瓜9930進行輻射，發現UV-B輻射可以有效抑制黃瓜幼苗的伸長和降低黃瓜葉片可溶性蛋白質含量，其中3.33 μmol/(m·s)的UV-B有利于黃瓜幼苗在人工氣候箱中生長，還提高了黃瓜幼苗的抗氧化酶活性和抗壞血酸含量，從而提高黃瓜幼苗的抗逆性。因此，分析誘變后黃瓜生理生化水平的變化，可為黃瓜生長提供理論依據，為黃瓜突變體庫的構建提供參考。

2.3 分子水平的影響

通過人為誘變技術對黃瓜幼苗代謝、光合作用、植物激素信號轉導等產生影響，可提高黃瓜的抗性。亓飛等通過對黃瓜EMS突變體庫中的長春密刺進行抗白粉病材料初篩， 然后進行苗期生理鑒定和PCR分析，最終篩選出2份突變體材料Mu-86-2和Mu-58-9。獨角金內酯(SLs類似物)可提高黃瓜對鹽脅迫的抗性，張小花對景潤35號黃瓜品系外源噴施GR24(SLs類似物)，發現外源GR24可以提高鹽脅迫下黃瓜幼苗的光合作用，增強抗氧化酶活性和抗逆基因表達，從而減輕黃瓜幼苗膜損傷，并通過轉錄組學分析，探究了SLs誘導黃瓜幼苗耐鹽性的分子機制，為黃瓜溫室種植提供理論指導。蔣景龍等通過對春夏秋王黃瓜根系施加外源HS，發現HS能調節組織細胞在鹽脅迫下的氧化還原和離子平衡過程，減輕黃瓜膜損傷，從而緩解鹽脅迫引起的損傷，并利用高通量測序和轉錄組學分析技術，探究了HS誘導黃瓜幼苗耐鹽性的機理。因此，分析誘變黃瓜產生抗性的分子機制，有助于研究抗性相關基因，為后續篩選抗性基因奠定基礎。

3 黃瓜突變體鑒定方法

3.1 表型鑒定

通過對植株表型進行觀察識別，對照野生型植株，直觀選擇出具有顯著變異的植株的方法。已經獲得矮化植株、白化苗、株型矮湊等重要黃瓜突變體類型。薛紅霞等通過對華南型高代自交系6457進行1.5% EMS處理10 h，構建了黃瓜突變體庫，在M2代221個單株中發現了葉片卷曲、超級子房、花萼葉片化、矮化植株等性狀。賀欒勁芝等以EMS誘變華南型黃瓜高代自交系6457得到的突變體M4代群體作為試驗材料，通過表型觀察，發現了果實變長、果實短筒等果實性狀突變體，總變異率達31.0%。Chen等利用1.6%EMS誘變黃瓜自交系WD1，獲得1個花和卷須突變體。Chen等利用1.5% EMS誘變北方生態型黃瓜自交系406種子12 h，通過表型觀察，發現了葉片、花器官和果實(圖3)等性狀的突變體，總變異率分別為33.6%、17.0%、26.9%。

3.2 生物化學鑒定

雖然表型性狀鑒定在黃瓜鑒定突變體方面被廣泛利用，但仍有點突變無法被鑒定出來，所以須要通過精確的篩選技術篩選出肉眼無法識別的變異類型。隨著黃瓜基因組測序的完成，TILLING技術已經廣泛應用在黃瓜育種研究中。TILLING技術是定向誘導基因組局部突變技術，最早由美國Fred Hutchinson癌癥研究中心所創建，利用單核苷酸多態性(SNP)進行突變體的篩選，獲得目標基因的突變體，現主要用于鑒定突變株，在黃瓜突變體庫的鑒定、優質種質資源構建、遺傳育種等方面都有廣泛的應用。Berg等應用TILLING技術在黃瓜突變群體中篩選出7個由EMS誘變的基因的突變植株，還通過化學方法進行生理指標分析，鑒定出無法明確通過表型性狀鑒定的突變體。陳皓煒等利用聚乙二醇6000模仿干旱環境，通過氮藍四唑(NBT)還原法、硫代巴比妥酸法、酸性茚三酮法等方法進行形態和生理指標分析，篩選出11個耐旱突變植株。

3.3 分子鑒定方法

分子檢測技術是通過檢測基因存在、缺陷或表達，對基因突變進行遺傳差異鑒定和定向改進。DNA分子標記輔助育種技術是應用于黃瓜遺傳多樣性最廣泛的方法，具有快速、高效和準確等優點，主要有限制性內切酶片段長度多態性(RFLP)、隨機擴增多態性DNA標記(RAPD)、ISSR(一種微衛星基礎上的分子標記)、目標起始密碼子多態性(SCoT)等。其中ISSR、SCoT操作簡單、成本低廉。 牛玉倩等通過EMS誘變得到黃瓜葉片白化突變體，通過簡單重復序列標記(SSR)標記法結合重測序結果開發的SNP和InDel標記對其目標基因進行定位，發現其位于黃瓜第7號染色體上約 66 kb 區間內。趙子瑤利用CRISPR/Cas9技術構建了2個靶序列，通過農桿菌介導sgDNA-Cas9-CsPID在黃瓜中進行遺傳轉化，PCR檢測出遺傳轉化率為1.7%、0.95%，但是并沒有發現突變體。韓杜斌利用藍光每天照射黃瓜津優35號8 h，發現黃瓜體內與煙粉虱抗性相關揮發物比對照上升，利用分子生物技術，通過篩選和基因沉默處理，鑒定出基因調控脂氫過氧化物裂解酶，從而影響反式-2-己烯醛的合成，影響反式-2-己烯醛在黃瓜驅避煙粉虱中的作用。郭嘉華等通過層析和田間誘導抗性試驗篩選西芹腐根二次酮層物，利用篩選出的最強流分RRA102誘導處理黃瓜津春4號幼苗，并進行轉錄組學分析，結果發現，西芹腐根二次酮層物誘導后能激發黃瓜幼苗的防御系統，提高對枯萎病的抗性。

4 轉錄組技術在黃瓜突變體庫中的應用

誘變育種的應用主要體現在目標性狀關鍵基因的定位與克隆和基因功能的解析，潘明等利用由EMS誘變的一個黃葉突變體，并通過圖位克隆方法與重測數據比對，發現了一個控制黃葉的突變基因，該突變基因通過調控植物體的光合作用從而導致黃葉形成。Yang等利用EMS誘變得到多個黃瓜毛狀體突變體，利用圖位克隆和BSA-seq相結合的方法將突變位點定位于6號染色體末端135.6 kb的區域內，通過遺傳分析發現無毛性狀是由隱性基因引起的。Chen等利用經EMS誘導形成的黃瓜突變體庫中的花和卷須突變體，通過圖位克隆和MutMap法結合將基因定位于WD9Indel10和WD9SNP2之間124 kb的物理距離內，經過轉錄組分析表明參與黃瓜卷須和花器官原基的發育。遇瑤等從黃瓜突變體Tnt1突變體庫中發現黃葉突變體，利用圖位克隆法發現突變是影響黃葉的候選基因。Rong等利用EMS誘變得到2個卷葉突變體和，通過圖位克隆的方法發現基因是導致卷葉突變的基因。Hao等利用EMS誘變得到黃瓜黃綠色果皮突變體，通過MutMap和KASP基因分型的方法，發現是黃瓜突變體的致病基因。Song等利用EMS誘變得到黃瓜突變體，利用精細的遺傳作圖將突變位點定位在Indel53和Indel56之間大約86.3 kb的物理距離內，通過遺傳分析的方法鑒定出是致病基因。

數量性狀易受外界環境影響，常有多個微效基因控制，所以數量性狀的基因的定位與克隆較質量性狀相對較難，相關性狀的研究也不及質量性狀深入。Wang等利用EMS誘變黃瓜CMCC得到1個種子萌發異常突變體，通過MutMap和KASP技術鑒定基因在黃瓜的萌發過程中具有一定的致死率。Hu等利用EMS誘變黃瓜自交系CMCC得到長下胚軸突變體，該突變是由突變引起的，對黃瓜下胚軸長度的調控起重要的作用。王琛通過前期的EMS突變體庫構建了根發育異常突變體，利用MutMap和KASP基因分型技術，鑒定為黃瓜根發育異常的致病基因。黃瓜數量形狀的定位與克隆由于受多基因控制，構建和鑒定過程困難，因此數量性狀的研究和解決這個問題的方法有待深入。

5 問題及展望

隨著研究的不斷深入，黃瓜誘變育種方面已經取得了很大的進步。但仍存在很多問題，如理化誘變產生的突變密度較高，篩選突變位點困難，并且在篩選突變體的過程中，由于表型觀察鑒定時效長，工作量大，易受外界環境影響，因此，容易遺漏一些非表型突變的性狀。黃瓜遺傳轉化體系仍然存在效率低、穩定性差的問題，從而影響黃瓜 T-DNA 插入突變體的獲得，阻礙黃瓜插入突變研究的進展。

如今，分子鑒定方法的應用越來越廣泛，在基因定位與克隆等方面發揮重要的作用。然而由于數量性狀受環境影響大，鑒定較困難，所以在數量性狀方面的基因定位與克隆不夠深入。在今后的育種過程中，應加強分子鑒定在誘變育種中的研究和應用，加快技術創新以獲得更多的突變材料，不斷提高效率，為培育高品質、抗性強的黃瓜新品種以及構建種質資源奠定基礎。