黃瓜CsNAC032基因的克隆及鹽脅迫響應(yīng)分析

李寶昌， 陳 岳，2， 張 涵， 張微微

(1.上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 201699； 2.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240)

轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物生長和逆境響應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的功能。其中NAC類家族蛋白是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子之一，其名字來源于矮牽牛的NAM (no apical meristem)、擬南芥的ATAF1/2 (transcription activation factor)和CUC2 (cup-shaped cotyledon)的首字母縮寫而成。NAC轉(zhuǎn)錄因子具有獨特的結(jié)構(gòu)特征，N端含保守的蛋白結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由A、B、C、D、E等5個亞結(jié)構(gòu)域組成。NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)中均發(fā)揮重要作用。例如擬南芥受到HO、NaCl和聚乙二醇的誘導(dǎo)表達(dá)，并通過響應(yīng)這些脅迫促進(jìn)葉片的衰老。此外，擬南芥的、和均受到鹽、干旱、脫落酸和茉莉酸的誘導(dǎo)表達(dá)。

黃瓜(L.)是葫蘆科一年生草本植物，是我國主要蔬菜作物之一。由于黃瓜根系脆弱、好氣、分布淺，因此對鹽脅迫十分敏感。發(fā)生鹽害時，會對黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重影響。因此，黃瓜耐鹽是近年研究熱點之一。劉東讓等對黃瓜耐鹽種質(zhì)資源進(jìn)行了篩選，同時提出了當(dāng)前黃瓜耐鹽脅迫育種中存在的問題。Zhu等在煙草中過表達(dá)黃瓜的基因，發(fā)現(xiàn)可以影響煙草中多胺和乙烯的合成，進(jìn)而提高煙草耐鹽性。Liu等利用耐鹽親本CG104和對鹽敏感的親本CG37構(gòu)建了重組自交系群體，通過圖位克隆獲得了1個耐鹽相關(guān)的主效QTL，并提出了2個候選基因。盡管NAC基因在植物中的耐鹽研究報道了很多，在黃瓜中卻鮮有報道。本研究通過同源克隆獲得了黃瓜基因，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，利用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)分析了該基因在不同器官中的表達(dá)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行鹽脅迫，分析處理后該基因的表達(dá)，為今后深入研究其功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 基因的克隆與鑒定

在TAIR網(wǎng)站下載擬南芥NAC032(AT1G77450)的蛋白序列，將該序列比對到黃瓜9930 V2版基因組(http：//cucurbitgenomics.org/ftp/genome/cucumber/Chinese_long/v2/)，獲得NAC032在黃瓜中的同源基因，將其命名為。在編碼區(qū)設(shè)計特異引物CsNAC032_F(5′-A T G A C C T T A G C T G G G C T C G T G-3′)和CsNAC032_R(5′-T T A A A T C T G C C T C T G T A G A T A A G A A A A C-3′)。以黃瓜葉片的cDNA為模板，CsNAC032_F和CsNAC032_R為引物，選用TaKaRa公司的PrimeSTAR Max Premix進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。將目標(biāo)片段連接至pClone007 Blunt Vector克隆載體，熱激法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用通用引物進(jìn)行菌落PCR篩選，將陽性克隆送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.2 CsNAC032的生物信息學(xué)分析

利用Expasy網(wǎng)站的“Compute pI/Mw tool”對的等電點與分子量進(jìn)行預(yù)測。利用ProtComp 9.0網(wǎng)站對的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測。利用PlantCARE網(wǎng)站的“Search for CARE”對的轉(zhuǎn)錄起始點上游2 000 bp的序列進(jìn)行啟動子元件預(yù)測。從NCBI (http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站中下載植物NAC-like序列(表1)。利用DNAMAN軟件對10種植物的序列進(jìn)行多序列比對，并通過MEGA X軟件構(gòu)建Neighbor Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(bootstrap值為1 000)。

表1 不同植物的NAC-like蛋白信息

1.3 黃瓜CsNAC032的表達(dá)分析

2021年9月在上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院五厙實訓(xùn)基地種植黃瓜自交系9930。當(dāng)黃瓜幼苗生長到5張真葉時，取根、莖、葉、子葉；當(dāng)黃瓜生長到20節(jié)位時，取雄蕊，雌蕊，花瓣，果刺，果皮，卷須。當(dāng)黃瓜處于5張真葉時，將100 mmol/L的NaCl添加到營養(yǎng)液中，并在處理后的1、3、6、12、24 h分別取葉片，每次取樣3個重復(fù)。樣本采取后立即置于液氮中，放于-80 ℃冰箱中備用。

通過全能型植物RNA提取試劑盒(DNase Ⅰ)分別提取各個器官的總RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiFiScript cDNA Synthesis Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)基因編碼區(qū)序列，設(shè)計特異性引物RT-CsNAC032F(5′-T T C A G A T T T C A C C C T A C T G A T G A G-3′)和RT-CsNAC032R(5′-G A G A T C A A T C T C C T T G A T G A T G G-3′)，用HiFiScript cDNA Synthesis Kit試劑進(jìn)行qRT-PCR試驗，檢測在黃瓜不同器官以及鹽處理后的表達(dá)情況。黃瓜()基因為對照。定量PCR相關(guān)試劑均購買于江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司。使用CFX96 TouchReal-Time PCR System進(jìn)行反應(yīng)，采用2-ΔΔ方法進(jìn)行基因的相對表達(dá)量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取與基因克隆

通過Blast比對，獲得擬南芥基因在黃瓜中的同源基因，將其命名為。利用黃瓜葉片cDNA對進(jìn)行擴(kuò)增，電泳檢測后發(fā)現(xiàn)在1 000 bp位置有單一條帶(圖1)。將該片段回收后連接克隆載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，測序結(jié)果顯示基因CDS長900 bp，編碼299個氨基酸，其相對分子質(zhì)量是34 271.63，等電點是5.67。亞細(xì)胞定位預(yù)測定位于細(xì)胞核，符合其轉(zhuǎn)錄因子的特性。

2.2 CsNAC032的進(jìn)化分析

利用DNAMAN軟件對黃瓜的CsNAC032和其他植物的9條NAC-like蛋白序列進(jìn)行相似性比對(圖2)。結(jié)果表明，黃瓜CsNAC032與甜瓜的CmNAC-like和冬瓜的BhNAC-like同源性最高，分別是97.00%和95.00%，與印度南瓜、中國南瓜、西葫蘆、苦瓜、野生灰籽南瓜、擬南芥、水稻的 NAC-like 蛋白同源性依次降低，分別為86.09%、85.76%、85.43%、82.24%、73.79%、56.92%、52.44%。此外，這些序列均擁有NAC家族蛋白典型的保守結(jié)構(gòu)域，在N端約150個氨基酸中共包含A、B、C、D、E等5個保守的亞結(jié)構(gòu)域。

為了分析黃瓜的CsNAC032在進(jìn)化中的位置，利用多序列比對的10條蛋白序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果(圖3)顯示，10條蛋白序列分為2組， 水稻的ONAC048和擬南芥的NAC032聚為一組，葫蘆科植物的NAC-like蛋白序列聚為另一組。其中，黃瓜CsNAC032與甜瓜的CmNAC-like和冬瓜的BhNAC-like蛋白又聚為同一亞組，說明它們的親緣關(guān)系較近，與多序列比對的結(jié)果一致。

2.3 啟動子元件分析

利用Plantcare對起始密碼子上游 2 000 bp 的啟動子區(qū)域進(jìn)行分析(表2)，結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)錄起始點上游除了含有真核生物啟動子固有的TATA區(qū)和CAAT區(qū)外，啟動子區(qū)域還包含1個防御脅迫響應(yīng)元件(defense and stress responsive)、1個赤霉素響應(yīng)元件(gibberellin responsive)、2個水楊酸響應(yīng)元件(salicylic acid responsive)、4個茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(meja responsive)、7個脫落酸響應(yīng)元件(abscisic acid responsive)和10個光周期響應(yīng)元件(light responsive)。

表2 CsNAC032啟動子區(qū)的順式作用元件分布及功能

2.4 CsNAC032基因在不同器官中的表達(dá)模式

利用qRT-PCR檢測基因在黃瓜不同器官中的表達(dá)情況，結(jié)果(圖4)顯示，在黃瓜子葉中相對表達(dá)水平最高，其次是根、果刺、莖、果皮、卷須中，在葉片、雄蕊、花瓣和雄蕊中表達(dá)水平較低。

2.5 CsNAC032基因在鹽脅迫處理下的表達(dá)模式

用100 mmol/L的NaCl處理黃瓜幼苗，分別于處理后1、3、6、12、24 h通過qRT-PCR檢測基因的表達(dá)水平，結(jié)果(圖5)顯示：在鹽脅迫的3 h后，表達(dá)水平升高，并于處理后12 h表達(dá)水平達(dá)到最高，達(dá)到初始水平的10倍左右，說明可以響應(yīng)鹽脅迫的誘導(dǎo)。

3 討論

本研究利用擬南芥的基因，通過同源克隆獲得了其在黃瓜中的同源基因。編碼區(qū)為900 bp，編碼299個氨基酸，N端含有NAC家族蛋白典型的結(jié)構(gòu)域，包含A、B、C、D、E 5個亞結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位預(yù)測CsNAC032主要在細(xì)胞核中發(fā)揮功能，進(jìn)化樹分析表明該蛋白與甜瓜的CmNAC-like(NP_001284423.1)親緣關(guān)系最近。qRT-PCR檢測基因在黃瓜不同器官中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在主要在根、莖、子葉、果刺等營養(yǎng)器官中表達(dá)，在雄蕊、雌蕊等生殖器官中相對表達(dá)水平較低，說明可能還參與了黃瓜營養(yǎng)器官的發(fā)育。

NAC是植物中廣泛存在的一類轉(zhuǎn)錄因子，大量的NAC轉(zhuǎn)錄因子受生物和非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。在啟動子上發(fā)現(xiàn)了多個響應(yīng)激素信號通路和逆境脅迫的元件，如防御脅迫響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件和光周期響應(yīng)元件，這些元件在黃瓜NAC家族基因啟動子中相對保守，這與辣椒和玉米NAC基因的啟動子元件分析結(jié)果類似。NAC基因可能通過這些元件受相應(yīng)的信號誘導(dǎo)表達(dá)。

番茄的NAC轉(zhuǎn)錄因子受到HO、NaCl、聚乙二醇(PEG)的誘導(dǎo)表達(dá)，基因TRV干擾掉后，番茄的抗干旱能力顯著下降。水稻的NAC家族膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子在NaCl和42 ℃的高溫處理后，表達(dá)量上調(diào)。利用CRISPR-Cas9技術(shù)編輯后，突變體對高溫脅迫敏感，耐熱能力減弱。在小麥中敲除會減弱植株的耐旱性，而該基因過表達(dá)后可以提高水分利用效率和增加脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)來顯著增強(qiáng)小麥耐旱性。水稻的、番茄的、葡萄的均受到NaCl、ABA、干旱以及高溫的誘導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)控下游基因以增強(qiáng)植物的抗逆能力。黃瓜受鹽脅迫后，在葉片的表達(dá)水平顯著上調(diào)，說明可能在黃瓜抵御鹽脅迫中發(fā)揮著一定功能。

本研究利用擬南芥的基因，通過同源克隆獲得了其在黃瓜中的同源基因。通過生物信息學(xué)方法對其序列以及表達(dá)進(jìn)行了分析，推測可能響應(yīng)鹽脅迫。本研究為進(jìn)一步研究其功能奠定了初步基礎(chǔ)，但其脅迫響應(yīng)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。