84K楊PagMSBP1/2a基因對木質素合成的影響*

胥雅靜 王佳偉 趙巖秋 江 成 黃李超 安 軼 曾 為 張 進 盧孟柱

(浙江農林大學林業與生物技術學院 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室 杭州 311300)

木材即次生木質部，是維管形成層細胞增殖、分化的產物，包含木質部細胞次生細胞壁加厚的過程(Chaffeyetal., 2002)。次生壁是木材的主要成分，主要由木質素、纖維素、半纖維素等構成。其中木質素是植物中含量僅次于纖維素的第二大高聚物(Zhangetal., 2020)。

木質素可提供植物機械支撐力，并可作為天然屏障抵御生物侵害，在植物生長過程中起重要作用(Voelkeretal., 2010)。木質素在木材產業上應用有利有弊：一方面木質素存在會降低傳統造紙的出漿率和紙張質量；另一方面木質素可作為生物質固碳并在新能源開發上得到利用(Wengetal., 2008)。基于對木質素的不同需求，利用轉基因技術調控木材中木質素含量具有重要意義(李少鋒, 2019)。

木質素由對香豆醇、松柏醇和芥子醇3種單體按照一定比例組合而成。木質素生物合成過程中有很多酶參與催化反應(Boerjanetal., 2003)，根據木質素生物合成途徑中不同酶的作用部位，可通過調節酶活性實現對木質素生物合成的調控。肉桂酸-4-羥化酶(C4H)、香豆酸-3-羥基化酶(C3′H)、阿魏酸-5-羥基化酶(F5H)是3種木質素單體合成的內質網定位細胞色素P450單氧酶，分別催化3種單體前體的合成。C3′H、C4H、F5H是具有錨點或成核中心的拓撲結構特征的Ⅰ型膜蛋白，能與該途徑中其他酶結合調控木質素代謝通路(Bassardetal., 2012; Scottetal., 2016)。在苜蓿(Medicagosativa)中降低C4H、C3′H表達能夠減少木質素含量，而F5H表達的改變不影響木質素的含量(Reddyetal., 2005)。在木本植物毛果楊(Populustrichocarpa)中有參與促進P450單氧酶形成復合物的膜蛋白，可以確保酶活性以進行高效催化(Chenetal., 2011)。

膜相關孕激素受體(MAPRs)是一類具有非共價細胞色素b5-like類固醇結合域(cytochrome b5-like haem/steroid-binding domain，Cyt-b5)的小分子蛋白質，可以調節P450酶活性(Chenetal.，2011; Kimuraetal.，2012; Ryuetal., 2017; Mifsudetal., 2002)。膜類固醇結合蛋白(MSBP)AtMSBP1是植物中鑒定的第一個膜類固醇結合蛋白，屬Cyt-b5蛋白超家族(Kaoetal.，2005; Mifsud et al., 2002)，MSBP1是擬南芥(Arabidopsisthaliang)中響應甾體信號的關鍵蛋白，在負調節細胞伸長、響應鹽脅迫和調控木質素合成等過程中發揮重要作用(Shietal., 2011; Witzeletal., 2018; Yangetal., 2008; Gouetal., 2018)。鑒于MSBP1對植物生長發育的多重影響，該蛋白被進一步認為是質膜衍生的內吞小泡，可以通過參與生長素轉運蛋白PIN2的循環調節生長素的再分配(Yangetal., 2008)，以及通過介導BR信號受體BAK1的內吞作用調節BR信號(Shietal., 2011; Songetal., 2009)。近期在擬南芥中發現，MSBP1可與其同系物MSBP2形成復合體，并與3種木質素單體合成P450單加氧酶相互作用，從而形成MSBP-P450酶蛋白復合物。MSBPs可以維持相互作用的P450酶的活性和穩定性，對于可溶性酚酯和苯丙烷類單體生物合成十分重要 (Shietal., 2011; Gouetal., 2018)。

楊樹是研究木本植物生長發育的模式物種，揭示楊樹木材形成機制可為林木育種提供重要理論支撐。基于MSBP調節植物生長發育的重要作用，研究其在楊樹木材形成，尤其是木質素合成中的作用具有重要意義。鑒于此，本研究通過構建系統發育樹和實時熒光定量PCR，從銀腺楊84K(PopulusalbaXP.glandulosa‘84K’)克隆得到擬南芥AtMSBP1同源基因PagMSBP1/2a，進行理化性質和亞細胞定位分析后，進一步構建PagMSBP1/2a基因過表達載體，并通過農桿菌介導的遺傳轉化法獲得過表達PagMSBP1/2a的轉基因楊樹，分析植株生長發育和木質素含量，為研究MSBP1對木本植物木質素合成的調控作用提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

試驗材料為銀腺楊無性系84K，由浙江農林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室林木木材品質研究團隊保存。試驗所用楊樹均由組培苗擴繁而來，并由組培苗移栽至培養土中繼續培養。楊樹幼苗培養條件為16 h/8 h(光照/黑暗)，溫度25 ℃。取不同組織樣品用于基因表達組織特異性分析。

試驗所使Gateway入門載體pDNOR207、帶GFP的過表達載體PMDC43、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α和農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101菌種均購自維地生物。總RNA提取試劑盒、DNA片段回收試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit購自TaKaRa公司，PCR高保真酶Prime STAR HS、DNA marker等購自南京諾唯贊生物科技有限公司，Gateway試劑盒購于Life Technologies公司。

1.2 楊樹MSBP基因獲取及結構分析

取擬南芥AtMSBP1序列在楊樹基因組中進行Blast分析，獲取楊樹MSBP基因的氨基酸序列； 通過MEGA7軟件基于遺傳距離的鄰近法構建擬南芥和楊樹的MSBP基因系統進化樹(Kumaretal., 2016)。根據擬南芥和楊樹的MSBP基因序列信息，通過GSDS2.0在線分析擬南芥和楊樹MSBP基因的內含子與外顯子結構，并繪制基因結構圖(Huetal., 2015)。

1.3 RNA提取、cDNA合成及組織特異性表達分析

將不同組織樣品在液氮中研磨成粉，頂芽、根、幼莖(1～3節間)、老莖(6～8節間)、葉的RNA提取與cDNA的合成分別采用RNAprep Pure Plant Kit(TIANGEN)和PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)完成，具體方法參見試劑盒使用說明。qPCR使用CFX96 Real-time PCR Detection System(Bio-Rad, Hercules, CA)，反應體系按照ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)說明書，每個樣品4個重復。PCR程序： 95 ℃，30 s預變性； 95 ℃，5 s變性，55 ℃，30 s退火，72 ℃，30 s延伸，35次循環。內參基因為PtACTIN。楊樹MSBP1/2基因定量引物(表1)使用在線引物設計軟件BatchPrime(https:∥probes.pw.usda.gov/batchprimer3/index.html)設計得到。利用楊樹資源數據庫(AspWood, http:∥aspwood.popgenie.org)獲取MSBPs在木材形成過程中的表達情況 (Sundelletal., 2017)。

1.4 楊樹PagMSBP1/2a基因的克隆與結構分析

根據毛果楊中PtMSBP1/2a(Potri.015G139800)基因序列，在銀腺楊84K基因組數據庫(Qiuetal., 2019)中進行Blast分析以得到其同源基因PagMSBP1/2a，使用Primer3設計特異引物PagMSBP1/2a-F和PagMSBP1/2a-R，以84K楊cDNA為模板，利用高保真聚合酶Prime STAR HS進行PCR擴增，得到目的基因PagMSBP1/2a后進行測序驗證。使用在線網站SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/interactive)和TMHMM網站(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對MSBP1/2a蛋白的三級結構和跨膜結構域進行分析預測。通過NCBI Blast(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/)和植物基因組網站(https:∥phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)對不同物種中MSBP1氨基酸序列進行查找獲取。利用DNAMAN軟件對多物種MSBP1蛋白氨基酸序列比對分析，獲得保守結構域。

表1 84K楊PagMSBP1/2基因克隆和定量PCR引物Tab.1 Primer sequences for 84K poplar PagMSBP1/2 cloning and qPCR analysis

1.5 載體構建及遺傳轉化

使用特異引物gw-PagMSBP1/2a-F和gw-PagMSBP1/2a-R，利用Gateway技術將PagMSBP1/2a基因連接至入門載體pDNOR207上，后分別連接至帶GFP熒光蛋白標簽的載體pMDC43和過表達載體pMDC32，轉化至大腸桿菌并測序驗證。將構建好的35S∷GFP-PagMSBP1/2a轉化至農桿菌GV3101中，并與內質網膜Marker SPAtWAK2-CFP-HDEL (cyan) (Zengetal., 2016)共同在野生型本氏煙草葉片下表皮細胞中表達，過夜暗培養后室溫培養3天取樣共聚焦顯微鏡觀察。將構建好的過表達載體35S∷pMDC32-PagMSBP1/2a利用農桿菌介導的葉盤法轉化84K楊(Zhouetal., 2019)，將篩選的轉基因植株提取RNA進行qPCR分析，選擇表達量較高的2個過表達轉基因株系進行試驗。

1.6 組織切片染色及木質素含量測定

每個株系各選3株在營養土中生長9周的楊樹苗，觀察植株生長的表型變化。取其基部節間約1 cm長，用振動式切片機(LEICA VT1 200 S)進行切片，厚度40 μm，分別用0.05%的甲苯胺藍O(TBO)染液和1%間苯三酚-HCL染液染色，鏡檢觀察，拍照記錄。

取生長5個月的PagMSBP1/2a過表達和對照84K楊莖部作為材料，樣品80 ℃烘干至恒質量，粉碎后過40目篩，稱取約5 mg(記為W)，采用乙酰溴法測定總木質素含量(Barnesetal., 2017; Fosteretal., 2010)，參照科銘生物的木質素含量檢測試劑盒說明書進行，按照以下公式計算木質素含量:

木質素(mg·g-1干質量)=((ΔA-0.006 8)×Vt×

10- 3×T)/(0.069 4×W)。

式中： ΔA為測定管OD280讀值-空白管OD280讀值；Vt為反應總體積2.04 mL；T為稀釋倍數；W為樣本質量。

2 結果與分析

2.1 楊樹MSBP基因的序列分析

以擬南芥MSBP1蛋白序列在毛果楊和84K楊基因組中進行同源序列比對，分別得到MSBP同源基因。利用MEGA7軟件構建楊樹和擬南芥MSBP基因的系統發育進化樹(圖1A)，楊樹中MSBP成員根據進化樹中兩物種間的對應關系進行命名，其中與AtMSBP1、AtMSBP2同源關系較近的基因有3個，分別命名為PtMSBP1/2a、PtMSBP1/2b和PtMSBP1/2c； 與AtMSBP3同源的基因有2個，分別命名為PtMSBP3a和PtMSBP3b； 與AtMSBP4同源的基因有2個，分別命名為PtMSBP4a和PtMSBP4b。84K楊中MSBP命名同理。同時利用GSDS2.0進行基因結構分析，構建結構圖(圖1B)。楊樹中MSBP1同源基因PtMSBP1/2a與PtMSBP1/2b長度均為2 kb左右，而PtMSBP1/2c長度不到1 kb，在基因結構上3個基因都各包含2個外顯子和1個內含子，與擬南芥MSBP1基因結構相比具有保守性，表明進化歷程中結構相對保守。

圖1 擬南芥與楊樹中MSBP基因分析Fig. 1 Phylogenetic tree and gene structure of MSBP from Arabidopsis and PopulusA.楊樹MSBP與擬南芥同源蛋白的系統進化樹分析 B.擬南芥與楊樹MSBP基因結構分析。Pt:毛果楊； At： 擬南芥； Pag: 84K。A. Phylogenetic tree analysis of homologous proteins of Populus and Arabidopsis. B. Structural analysis of MSBP genes in Arabidopsis and Populus. Pt: Populus trichocarpa; At: Arabidopsis thaliana； Pag: 84K.

圖2 PtMSBP1/2基因表達分析Fig. 2 Tissue-specific expression analysis of PtMSBP1/2A. qPCR分析PagMSBP1/2a、PagMSBP1/2b和PagMSBP1/2c基因在84K楊樹頂芽、葉、幼莖、老莖和根中的表達; B.楊樹PtMSBP1/2a、PtMSBP1/2b和PtMSBP1/2c基因在韌皮部、形成層及木質部中的表達。A. qPCR analysis of the expression of PagMSBP1/2a, PagMSBP1/2b and PagMSBP1/2c genes in 84K poplar top buds, leaves, young stems, old stems, and roots; B. Analysis of PtMSBP1/2a, PtMSBP1/2b PtMSBP1/2c gene in phloem, cambium and xylem expression.

圖3 PagMSBP1/2a序列結構分析Fig. 3 The sequence analysis of PagMSBP1/2aA. 6種植物同源MSBP1蛋白氨基酸序列比對，下劃線代表Cyt-b5保守結構域； B.PagMSBP1/2a蛋白三級結構預測； C. PagMSBP1/2a氨基酸序列的跨膜結構域預測,峰值即代表跨膜結構域。A. Alignment of the amino acid sequence of MSBP1 protein with homologous genes of other species, the underline represents the Cyt-b5 conserved domain; B. PagMSBP1/2a protein tertiary structure prediction; C. The transmembrane domain prediction of PagMSBP1/2a amino acid sequence, the peak value represents the transmembrane domain.

圖4 PagMSBP1/2a亞細胞定位分析Fig. 4 Subcellular localization of PagMSBP1/2aA. GFP-PagMSBP1/2a亞細胞定位載體圖; B.熒光共聚焦表明PagMSBP1/2a定位在內質網。A. PagMSBP1/2a subcellular localization vector map; B. GFP-PagMSBP1/2a localized on the endoplasmic reticulum by fluorescence confocal microscope tracking.

2.2 楊樹MSBP基因組織表達分析

取土培6個月的84K楊的頂芽、葉、嫩莖、老莖和根提取RNA，qPCR分析PagMSBP1/2a、PagMSBP1/2b和PagMSBP1/2c基因表達情況，結果表明，3個基因在頂芽、葉、莖和根中均有表達，其中PagMSBP1/2c在各組織的表達量相對較低。PagMSBP1/2a在老莖表達量最高，為表達量最低的幼莖中的6倍，另外，PagMSBP1/2a在莖中的表達顯著高于其他2個基因(圖2A)。參考AspWood數據庫(http:∥aspwood.popgenie.org)對3個基因在韌皮部、形成層及木質部中的表達譜進行數據分析，發現楊樹MSBP1的3個成員均在成熟木質部表現出高表達，同時根據相對表達量分析，發現PtMSBP1/2a在木質部與韌皮部中的表達相對較高(圖2B)。為此，本研究選擇PagMSBP1/2a基因深入研究其在楊樹木材形成中的調控作用。

2.3 PagMSBP1/2a基因克隆及序列分析

對84K楊中克隆出的PagMSBP1/2a基因分析發現，PagMSBP1/2a包含一個全長648 bp 的CDS，編碼215個氨基酸，由2個外顯子組成，分子量為2.33 kDa，理論等電點(PI)為4.53。利用DNAMAN軟件進行多重序列比對表明，PagMSBP1/2a蛋白序列與毛果楊、擬南芥、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)和番茄(Solanumlycopersicum)5種植物的MSBP1蛋白序列相似度較高，一些區域存在明顯的保守序列。MSBP蛋白在單子葉和雙子葉植物中具有一定保守性，且都有Cyt-b5結構域(圖3A)。應用ExPAsy提供的SWISS-MODEL 對PagMSBP1/2a蛋白的三級結構進行預測，以人類膜相關孕激素受體組分1(PGRMC1)蛋白(4x8y.1.A)為模板，同源建模PagMSBP1/2a蛋白的完整氨基酸序列，預測所得模型見圖3B，分析表明此蛋白具有類固醇結合結構域，是一個α+β混合結構，2對α-螺旋在β-折疊的一側形成三明治口袋結構。采用TMHMM網站對MSBP1蛋白的跨膜結構域進行預測，結果表明，PagMSBP1/2a在N端第22～44位氨基酸形成跨膜結構域(圖3C)。

2.4 亞細胞定位分析

將35S∷GFP-PagMSBP1/2a重組載體在煙草表皮細胞中瞬時表達，分析其在細胞中的定位。結果表明，在注射含有35S∷GFP-PagMSBP1/2a過表達載體農桿菌的本氏煙草葉片表皮細胞中，在488 nm波長的激發光下使用共聚焦熒光顯微鏡觀察到的GFP熒光信號與內質網Marker重合，表明PagMSBP1/2a蛋白定位于內質網(圖4)。

2.5 PagMSBP1/2a過表達載體的構建與遺傳轉化

為深入研究PagMSBP1/2a基因對楊樹生長發育的作用，實驗構建了35 S∷35S∷PagMSBP1/2a表達載體(圖5A)，采用農桿菌介導的葉盤法轉化楊樹，獲得了過量表達的轉基因株系(PagMSBP1/2a-OE)。通過PCR鑒定和qPCR檢測表達情況后，獲得PagMSBP1/2a過量表達的陽性轉基因苗。選取2個表達量較高的株系#24、#33進行試驗(圖5C)。生長9周的過表達PagMSBP1/2a楊樹株高生長明顯低于對照(圖5B)。統計結果顯示，過表達PagMSBP1/2a楊樹2個株系株高分別比對照株高減少21%、5%。

圖5 PagMSBP1/2a過表達載體圖譜及轉基因植株Fig. 5 PagMSBP1/2a overexpressed vector and transgenic PopulusA.PagMSBP1/2a過表達載體圖 B. PagMSBP1/2a過表達植株表型C.選定的過表達植株PagMSBP1/2a基因的相對表達量。A. Vector of PagMSBP1/2a overexpression. B. Phenotype of PagMSBP1/2a overexpressed Populus C. Relative expression of PagMSBP1/2a gene in selected overexpressed plants.

2.6 過表達PagMSBP1/2a對木質素合成的影響

MSBP1是調控木質素合成過程的重要支架蛋白，為研究PagMSBP1/2a基因在木質素合成中發揮的作用，對PagMSBP1/2a過表達株系#24和#33進一步解剖分析。觀察莖橫切面染色情況，發現過表達PagMSBP1/2a楊樹比對照組間苯三酚-HCL染色淺，說明其木質素的含量有所降低。利用乙酰溴法測定木質素含量，在過表達PagMSBP1/2a株系#24和#33中，木質素含量與對照組相比分別減少34.6%、26.5%。

圖6 過表達PagMSBP1/2a 影響木質素合成Fig. 6 PagMSBP1/2a affects lignin biosynthesis比例尺Scale bar in A-C is 200 μm; and in D-E is 80 μm.； C： 第7節間橫切片甲苯胺藍O染色(A： 對照植株，B-C： 轉基因株系#24、#33)； D-F： 第7節間橫切片間苯三酚-HCL染色(D： 對照植株，E-F： 轉基因株系#24、#33)； G.乙酰溴法測定木質素含量。t檢驗P值用星號表示，***表示差異極顯著(P<0.01)。A-C. 7th internode transverse section stained with TBO (A, control plants; B, C, transgenic plants #24, #33, respectively); D-F. 7th internode transverse section phloroglucinol-HCL staining (D, control plants; E, F, transgenic plants #24, #33, respectively); G. Acetyl bromide method to determine the content of lignin. The P value of t test is indicated by stars,*** indicate extremely significant difference (P<0.01).

3 討論

木材形成是一個極為精細的過程，對于次生壁的合成機制已進行大量研究工作，目前木質素的生物合成及調控通路解析取得較大進展(Shietal., 2010)。最近表明，MSBP1作為動物膜相關孕激素受體PGRMC1(Falkensteinetal., 1996)同源基因在木質素合成中有重要作用(Shietal., 2011; Gouetal., 2018)。本研究對MSBP在楊樹中的7個成員進行分析，包括進化關系、基因結構及其在楊樹組織中的表達等。分析發現，楊樹中MSBP蛋白結構相對保守，均具有Cyt-b5保守結構域(Mifsudetal., 2002)，推測MSBP在功能上可能具有高度保守性。

結合組織定量分析以及AspWood在線分析表明，MSBP1/2a基因在成熟莖段的木質部表達水平高(圖2)。擬南芥MSBP1以前被認定為質膜蛋白，可作為類固醇/BR激素信號成分負調控細胞伸長(Yangetal., 2005)，后來熒光蛋白GFP介導的亞細胞定位研究表明，MSBP1主要是一種內質網駐留蛋白(Gouetal., 2018)，本研究的PagMSBP1/2a亞細胞定位也證實了這一觀點(圖4)。MSBP1/2a的表達模式和定位分析表明MSBP1可能對莖的生長發育有影響，因此本文對84K楊中在木質部組織高表達的PagMSBP1/2a進行深入研究。

NST是NAC家族中參與調節次生壁加厚 (Mitsudaetal., 2007) 的重要轉錄因子，有研究證明在nst-1突變體中MSBP基因的表達降低了50%左右 (Gouetal., 2018)，同時發現在楊樹的發育木質部中MSBP同源基因表達水平較高 (Baoetal., 2013)，這證明MSBP1和MSBP2與次生細胞壁合成和木質素的形成相關。在擬南芥突變體msbp1進一步的實驗中，抑制MSBP2表達會致使C4H、C3′H和F5H蛋白水平的大幅下降以及C4H酶催化活性的降低，使植株呈現木質化程度低的表型(Gouetal., 2018)。采用間苯三酚-HCL對6周大的擬南芥基莖測定維管束和束間纖維的染色強度發現，雙基因敲除系與野生型msbp2-1相比明顯較弱，表明雙基因敲除植株維管中木質素總量降低(Gouetal., 2018)。本研究通過過表達楊樹PagMSBP1/2a基因，乙酰溴法測定轉基因植株成熟莖段的木質素含量，PagMSBP1/2a過表達植株中的木質素含量明顯低于對照植株(圖6G)。本研究中過表達MSBP1導致木質素含量降低的結論，與已報道的減少MSBP1表達會降低木質素含量相矛盾。原因可能是植物在調節木質素合成途徑中對MSBP1蛋白具有嚴苛的要求。MSBP1做為支架蛋白連接P450酶在內質網膜形成蛋白復合體，維持酶的活性和穩定性，MSBP1蛋白的增多極有可能打破了復合體的調控平衡，導致3個P450酶的排列及功能發生變化，從而直接影響復合體催化木質素的形成。有研究稱在苜蓿中C3′H、C4H表達下降的植株中乙酰溴化木質素含量降低，而F5H表達降低不影響總含量。C4H、F5H的降低都提高了木質素G單體的比例，并且F5H的降低還增加了硫代酸解木質素的含量(Reddyetal., 2005; Stewartetal., 2009)。說明C3′H、C4H、F5H在木質素合成途徑中存在精密的調控平衡中，MSBP作為木質素合成的關鍵調控因子，與相關酶的互作關系直接影響其調控作用的發揮，且PagMSBP1/2a與其他成員之間是否存在相互作用也有待進一步研究。本研究表明了該基因過量表達可以降低木質素的含量，但植株生長受到了較大影響。因此若采用該基因啟動子進行木質部細胞特異表達，則可能實現PagMSBP1/2成員對木質素合成過程的精準調控。

4 結論

本研究克隆了84K楊PagMSBP1/2a基因，預測其編碼膜蛋白，與其定位在內質網膜相一致。PagMSBP1/2a基因在成熟莖中表達量較高，尤其在木質部發育中表達量最高。通過高表達PagMSBP1/2a證明了其參與木質部發育過程，導致植株矮化，木質素含量減少。PagMSBP1/2a在木材形成過程中的調控作用，可以作為靶基因進行分子育種，調控木質素的含量。