多酚交聯的殼聚糖水凝膠的制備及其性質研究

＊胡亞云 張英萍 陳琳

（西北農林科技大學食品科學與工程學院 陜西 712100）

水凝膠是由水溶性高分子經過交聯后形成的三維網絡結構，能夠吸收并保持大量的水，其具有良好的生物相容性和親水性[1]，類似生物體軟組織，在生物醫學領域有著廣泛的應用[2]。殼聚糖基水凝膠具有良好的細胞相容性、可降解性和低毒性，在食品生物醫藥領域被廣泛研究[3]。以單一的殼聚糖為原料制成的水凝膠存在機械性能及保水性差等不足使其應用受限。將多酚物質和殼聚糖混合后制備的多酚/殼聚糖水凝膠綜合了多酚生物活性及殼聚糖的優良特性，具有良好的應用價值。

1.材料與方法

(1)材料與儀器

殼聚糖（CS），脫乙酰度＞95%，黏度100～200mPa·s上海麥克林生化科技有限公司；沒食子酸（GA）和MTT，Sigma-Aldrich（上海）貿易有限公司；30%過氧化氫（30% H2O2），深圳華大基因科技有限公司。

M4 Victor X3多功能酶標儀，上海美谷分子儀器有限公司；TA-XT Plus質構儀，英國薩里穩定微系統有限公司；BSC-1500IIA2-X生物安全柜，濟南鑫貝西生物技術有限公司。

(2)實驗方法

①氧化沒食子酸的制備。將沒食子酸和過氧化氫混合，然后將該溶液體系放入90℃的水浴鍋中加熱2h，取出后在室溫冷卻30min。隨后將GA溶液冷凍干燥，以完全除去H2O2。

②水凝膠的制備。將殼聚糖溶液與不同質量濃度的沒食子酸混合，分裝到12孔板，在-18℃冰箱中放置12h后取出，室溫解凍2h得到水凝膠。

③水凝膠的表征。A.傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）。參考Thanyacharoen[4]的方法，用傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）對樣品官能團信息進行測定。

B.流變測試。參考Guaresti[5]的方法，用美國Waters TA流變儀（DHR-1）進行測定。

C.質構測試。參考Qi[6]的方法，使用英國STABLEMICVO公司TA.XT PLUS/50進行循環壓縮測試。

D.差示掃描量熱儀（DSC）。參考Kandile[7]的方法進行測定。

E.溶脹率。水凝膠溶脹率的測定首先將在室溫下在去離子水中平衡的冰凝膠稱重（WE），然后將其凍干并再次稱重（WO）。溶脹率SR（%）通過公式(1)計算：

式中：SR表示溶脹率，%；WE表示冰凝膠在室溫下在去離子水中平衡重量，g；Wo表示冰凝膠凍干后的重量，g。

④體外細胞毒性測定。根據先前的方法[8]對水凝膠體外細胞毒性進行測定。細胞活性按照公式（2）計算：

式中：Ap表示處理組在490nm處的吸光度值；Ac表示對照組在490nm處的吸光度值。

(3)數據處理

單項實驗最少重復3次，結果表示為均值±標準差。采用SPSS V18.0軟件對數據進行單因素方差分析和相關性分析，如果方差分析差異性顯著（p＜0.05），則使用Duncan進行多重比較。

2.結果與分析

(1)傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)分析

圖1顯示，與CS的峰相比，6種樣品在1631cm-1附近顯示出明顯的峰，對應于CS和GA之間的C=N鍵的伸縮振動吸收峰，表明CS與GA之間形成了席夫堿鍵[9]。而沒食子酸或殼聚糖單獨存在時，不能檢測到酯鍵和C=N鍵。這些結果表明水凝膠中沒食子酸與殼聚糖的綴合[10]。887cm-1的吸收峰為糖環伸縮振動吸收峰，說明CS和OGA反應并沒改變CS的骨架。

圖1 CS、GA和不同濃度CS-GA水凝膠的FTIR光譜

(2)流變學測試

由圖2可知殼聚糖水凝膠的儲能模量值均隨著OGA濃度的增加呈上升趨勢。這是因為隨著殼聚糖和沒食子酸濃度的增加，二者所提供的交聯位點增加，使得交聯后分子鏈纏繞聚集更加緊密。同時在ω=0.01～100rad/s范圍內，儲能模量＞損耗模量，即G′＞G″，這說明6種水凝膠表現為粘彈性固體。

圖2 不同濃度CS-GA水凝膠的儲能模量(a)和損耗模量(b)隨角頻率(0.1～100rad/s)的變化曲線圖

(3)質構測試

圖3所示，隨著GA濃度的增加，顯著提高了水凝膠的硬度，形成更堅固耐用的水凝膠。另外，2% CS比1.5% CS制備的水凝膠硬度顯著提高，這是由于高濃度殼聚糖可以形成更致密的結構。其次，2%的殼聚糖由于其結構更加致密，含水量減小。

圖3 不同濃度CS-GA水凝膠的硬度圖柱上標不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）

(4)溶脹性

圖4可知，6種水凝膠的溶脹率均在60%以上，最高溶脹率可達到332.89±20.5%，說明6種水凝膠均具有良好的溶脹性能。水凝膠樣品的溶脹率均隨著GA濃度的升高而降低，這主要是因為水凝膠網絡的內部結構交聯纏結加劇導致水凝膠內部更高的交聯強度，削弱了水分子正常滲透。2% CS水凝膠溶脹率顯著小于1.5% CS，這是更高的濃度提供更多的交聯位點，使分子間存在更高的交聯密度，形成了更加緊密的凝膠網絡結構。

圖4 不同濃度CS-GA水凝膠的溶脹率圖柱上標不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）

(5)熱穩定性

圖5為6種水凝膠在20～250℃的升溫程序內的熱流變化。CS1.5%-GA1%、CS1.5%-GA2%、CS1.5%-GA3%、CS2%-GA1%、CS2%-GA2%、CS2%-GA3%水凝膠的最大降解溫度分別為113℃、113℃、116℃、114℃、113℃、116℃。100℃附近的降解變化可能歸因于殼聚糖解聚產物的降解。6種凝膠的熱降解溫度結果相差不大，但總體而言，更高的GA濃度即更高的交聯程度，可能使CS結晶度提高使其熱穩定性提高。

圖5 不同濃度CS-GA水凝膠的DSC曲線

(6)體外細胞毒性

MTT實驗結果證實，6種CS-GA水凝膠的細胞存活率均在100%以上。結果說明水凝膠對C2C12細胞生長無明顯抑制作用，而且能夠促進C2C12細胞的增殖，具有良好的細胞相容性。另外隨著GA濃度的增加，細胞存活率顯著降低，原因可能是隨著水凝膠內部交聯程度的進一步增加，內部供細胞生長、增殖的孔隙進一步減小，從而導致細胞存活率降低。

圖6 不同濃度CS-GA水凝膠的細胞存活率圖柱上標不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）

3.結論

研究結果表明，使用CS和GA通過冷凍-解凍的方法來制備水凝膠是切實可行的。CS與OGA通過席夫堿反應進行交聯，冷凍解凍進一步形成交聯網絡。GA的加入不僅水凝膠的機械強度得到了改善，還具有良好的熱穩定性，較好的溶脹性能。體外細胞毒性結果表明，CS-GA水凝膠能促進C2C12細胞的增殖，具有良好的細胞相容性。以上結果表明，含有CS-GA水凝膠在生物醫學領域中有很大的應用前景，尤其適用于作為傷口敷料。