沙苑子苷A對脂肪變L02細胞中三酰甘油水解及炎癥介質(zhì)的影響

高 晶 魏益謙 孟智睿 邵紫萱 李 麗 張建軍 王景霞

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029)

血脂異常(Dyslipidemia)指血漿中脂質(zhì)量和質(zhì)的異常，通常指血漿中總膽固醇(Total Cholesterol，TC)和(或)三酰甘油(Triacylglycerol，TG)升高，也包括高密度脂蛋白膽固醇(High Density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C)降低。由于脂質(zhì)不溶于水或微溶于水，在血漿中與蛋白質(zhì)結(jié)合以脂蛋白的形式存在，因此，血脂異常實際上表現(xiàn)為脂蛋白異常血癥(Dyslipoproteinemia)[1]。長期高脂飲食及持續(xù)血脂異常會增加動脈粥樣硬化的危險，并可導(dǎo)致腦血管病、心血管病尤其是冠心病及周圍血管病的發(fā)生，因此積極控制預(yù)防具有重要意義[2]。本病可歸屬于中醫(yī)學(xué)“脂濁”范疇，中醫(yī)學(xué)認為本病多為本虛標(biāo)實，主要的病機是肝、脾、腎虛，痰濁瘀血，阻滯經(jīng)脈，而致膏脂布化失度[3]。沙苑子為豆科植物扁莖黃芪(AstragaluscomplanatusR.Br.)的干燥成熟種子，是中醫(yī)臨床常用的溫補腎陽的藥物，主要針對腎陽不足，痰濁日久而導(dǎo)致的高脂血癥，具有溫陽化濁的作用[4-5]。沙苑子的化學(xué)成分非常豐富，包括多肽類、黃酮類、酚類、鞣質(zhì)、三萜類、生物堿類、甾醇等[6]。課題組前期研究顯示沙苑子黃總黃酮具有良好的調(diào)節(jié)血脂的作用，能夠降低高脂大鼠血清TG、TC、低密度脂蛋白膽固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C)水平，升高HDL-C水平，能抑制肝臟固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(Sterol Regulatory Element Binding Protein-1c，SREBP-1c)表達，上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體α(Peroxisome Proliferator Activated Receptor α，PPARα)表達，減少TG在肝臟的沉積，從而達到調(diào)脂作用[7-9]。沙苑子苷A是沙苑子總黃酮中含量較高的一種黃酮類成分[10]，本研究采用人L02肝細胞體外脂肪變性模型，探討沙苑子苷A對脂肪變性細胞損傷、TG脂肪酶(Adipose Triglyceride Lipase,ATGL)、相關(guān)核受體過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome Proliferators-activated Receptor，PPAR)以及炎癥介質(zhì)的影響，以期進一步明確沙苑子降血脂的物質(zhì)基礎(chǔ)及其調(diào)節(jié)血脂的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人正常肝L02細胞株，購自武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號：CL-0111。

1.1.2 藥物 沙苑子苷A(Apexbio公司，美國，批號：N240321337769)。

1.1.3 試劑與儀器 高糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國，批號：sh30284.01)，胰蛋白酶-EDTA消化液(Sigma-Aldrich公司，美國，批號：T4299)，青鏈霉素(Invitrogen公司，美國，批號：V900929)，胎牛血清(Gibco公司，美國，批號：V900933)，牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)(Gibco公司，美國，批號：10099-141)，棕櫚酸鈉(Sigma-Aldrich公司，美國，批號：P9575)，油酸鈉(Sigma-Aldrich公司，美國，批號：07501)，二甲基亞礬(Sigma-Aldrich公司，美國，批號：DMSO)，蛋白裂解液(Sigma公司，美國，批號：r0278)，二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)法蛋白含量測定試劑盒(批號：KGP902)、TG試劑盒(批號：A110-1-1)、TC試劑盒(批號：A111-1-1)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)試劑盒(批號：A003-1-2)、過氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)試劑盒(批號：A001-3-2)均購于南京建成生物工程研究所，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(Sigma-Aldrich公司，美國，批號：APOAF-20TST)，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR)檢測主要實驗材料：引物(北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成)，Trizol(Invitrogen公司，美國，批號：15596018)，核糖核酸酶(Ribonuclease，RNase)抑制劑[Fermentas(MBI)公司，美國，批號：eo0382]，RNase-free H2O(Fermentas(MBI)公司,美國，批號：eo0521)，轉(zhuǎn)錄酶、qPCR Mix(APEXBIO公司，美國，批號：K1070-5000)，ATGL抗體(Sigma-Aldrich公司，美國，批號：P1872)，PPAR-α(Abcam公司，英國，批號：epr18516)，PPAR-γ(Sigma-Aldrich公司，美國，批號：SAB4502262)，白細胞介素-6(Interleukin，IL-6)(Sigma-Aldrich公司，美國，批號：I1395)抗體，腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)-α抗體(Sigma-Aldrich公司，美國，批號：RAB0522)，抗兔IgG辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)(Cell Signaling公司，美國，批號：ab6721)，超凈工作臺(青島海爾股份有限公司，型號：HCB-1300V)，二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國，型號：HERAcell 2401)，高速低溫離心機(Eppendorf公司，德國，型號：5424r)，倒置顯微鏡(Olympus公司，日本，型號：CKX31)，EPICS-XL型流式細胞儀(Beckman-Coulter，美國，型號：XL-MCL)，全自動生化分析儀(Rayto公司，美國，型號：CHEMRAY 120)，酶標(biāo)儀(Thermo公司，美國，型號：1410101)，7500實時定量PCR儀(美國BIO-RAD公司，美國，型號：7500)，電泳儀(Bio-Rad公司，美國，型號：1645050-OG)、轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司，美國，型號：1704150)，凝膠成像系統(tǒng)(UVP公司，美國，型號：e142362)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 根據(jù)L02細胞的給藥濃度不同設(shè)置對照組、模型組和受試藥低劑量、中劑量、高劑量組。L02細胞用含10%胎牛血清Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium，DMEM)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，傳代。于96孔板和(或)24孔板中加入L02細胞，培養(yǎng)至融合80%，加入含有1% BSA、1 mmol/L的游離脂肪酸(Free Fatty Acids，F(xiàn)FA)混合液(油酸∶軟脂酸為2∶1)的DMEM培養(yǎng)基，構(gòu)建脂肪肝細胞模型。

1.2.2 給藥方法 受試藥細胞分別加入1、10、50 μmol/L沙苑子苷A工作液(沙苑子苷A粉末溶于二甲基亞砜配制)預(yù)處理24 h后，再加入FFA混合液孵育24 h，隨后測定相應(yīng)的指標(biāo)。

1.2.3 指標(biāo)檢測與方法

1.2.3.1 流式細胞儀檢測L02細胞凋亡 收集各組細胞，細胞用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Saline，PBS)洗滌2次。重懸細胞，用10 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI避光常溫孵育5 min，流式細胞儀分析測得數(shù)據(jù)。

1.2.3.2 流式細胞儀檢測L02細胞脂肪堆積 收集各組細胞，冰PBS洗滌2次×10 min，重懸于1 μmol/L尼羅紅染液1 mL，室溫避光振蕩染色30 min，冰PBS洗滌2次，重懸于500 μL PBS，流式細胞儀(490 nm excitation/570 nm emission)隨機計數(shù)10 000個細胞，檢測其熒光強度，各處理組檢測熒光強度與對照組比較，計算倍數(shù)變化。

1.2.3.3 L02細胞TG、TC、MDA含量和SOD活力的測定 收集各組細胞，嚴格按照試劑盒說明書，應(yīng)用全自動生化分析儀檢測TG、MDA含量、SOD活性水平。

1.2.3.4 實時熒光PCR檢測ATGL、PPAR-α、PPAR-γ、IL-6、TNF-α mRNA表達 提取各組細胞總RNA，根據(jù)產(chǎn)品說明書操作。用生物分光光度計測定RNA濃度和純度。取2 μg RNA樣本，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以此為模板進行PCR擴增反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄和PCR條件按照試劑盒說明書設(shè)置。PCR進行35～40個循環(huán)：預(yù)變性95 ℃，2 min；變95 ℃，30 s；58 ℃退火，30 s；72 ℃延伸30 s。ATGL上游引物為5′-ACATCCGGTGGATGAAGGAG-3′，下游引物為5′-GGCAGTGCCTCTCTGTAGG-3′；PPARα上游引物為5′-ACGATTCGACTCAAGCTGGT-3′，下游引物為5′-AAACGAATCGCGTTGTGTGA-3′；PPARγ上游引物為5′-CTAAAGAGCCTGCGAAAGCC-3′，下游引物為5′-GGCGGTCTCCACTGAGAATA-3′；TNF-α上游引物為5′-CTGCACTTTGGAGTGATCGG-3′，下游引物為5′-AGGGTTTGCTACAACATGGG-3′；IL-6上游引物為5′-AAGCCTCCCAGTGCAAGATT-3′，下游引物為5′-ATGCATGCTTGTCTTGCCTT-3′；GAPDH上游引物為5′-CTCATGACCACAGTCCATGCC-3′，下游引物為5′-TTCCCGTTCAGCTCAGGGAT-3′。實時定量PCR結(jié)果采用2-△△Ct法計算相對表達量。

1.2.3.5 蛋白質(zhì)印跡(Western Blotting)法檢測ATGL、PPAR-α、PPAR-γ、IL-6、TNF-α蛋白表達 收集各組細胞，蛋白裂解液裂解細胞，4 ℃離心(離心半徑8 cm、轉(zhuǎn)速12 000 r/min、時間15 min)取上清液，BCA法測定蛋白含量，總蛋白50 μg上樣，經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Nitrocellulose Filter Membrane，NC膜)上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉后加入1∶1 000稀釋的相應(yīng)的一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗3次，加入1∶2 000 HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗3次后，用Western Blotting熒光檢測試劑盒顯影、定影。結(jié)果用圖像分析儀分析。

2 結(jié)果

2.1 沙苑子苷A對脂肪變L02細胞凋亡的影響 對照組的細胞凋亡率為(5.43±1.93)%，而模型組L02細胞的凋亡率為(41.54±11.17)%，顯著升高(P<0.01)。沙苑子苷A低劑量、中劑量、高劑量組的細胞凋亡率分別為(33.40±6.11)%、(26.61±5.54)%、(15.73±3.51)%，均有顯著降低(均P<0.05)。見圖1。

圖1 不同濃度沙苑子苷A對L02細胞凋亡的影響

2.2 沙苑子苷A對肝脂肪變L02細胞脂肪堆積的影響 與對照組比較，模型組的脂肪堆積明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，沙苑子苷A低劑量、中劑量、高劑量組L02細胞脂肪堆積均減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見圖2。

圖2 不同濃度沙苑子苷A對L02細胞脂肪堆積的影響

2.3 沙苑子苷A對脂肪變L02細胞內(nèi)TG、TC含量的影響 與對照組比較，模型組L02細胞TG、TC含量均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)；與模型組比較，沙苑子苷A中、高劑量L02細胞TG含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，沙苑子低劑量、中劑量、高劑量L02細胞TC含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 沙苑子苷A對L02細胞內(nèi)TG、TC含量的影響

2.4 沙苑子苷A對脂肪變L02細胞內(nèi)MDA含量和SOD活力的影響 與對照組比較，模型組L02細胞MDA含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，沙苑子苷A中、高劑量L02細胞MDA含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。與對照組比較，模型組L02細胞SOD活力水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；沙苑子低劑量、中劑量、高劑量L02細胞SOD活力水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 沙苑子苷A對L02細胞內(nèi)MDA、SOD水平的影響

2.5 沙苑子苷A對ATGL、PPAR-α、PPAR-γ、TNF-α、IL-6 mRNA表達的影響 與對照組比較，模型組L02細胞ATGL、PPAR-α、PPAR-γmRNA表達均顯著升高(均P<0.01)；與模型組比較，沙苑子苷A低劑量、中劑量、高劑量組L02細胞ATGL、PPAR-α、PPAR-γmRNA表達均顯著升高(P<0.05，P<0.01)。與對照組比較，模型組L02細胞TNF-α、IL-6 mRNA表達均顯著升高(均P<0.01)；與模型組比較，沙苑子苷A低劑量、中劑量、高劑量組L02細胞TNF-α、IL-6 mRNA表達均顯著降低(均P<0.01)。見表3。

表3 沙苑子苷A對TG代謝相關(guān)基因表達的影響

2.6 沙苑子苷A對ATGL、PPAR-α、PPAR-γ、IL-6、TNF-α蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組L02細胞ATGL、PPAR-α、PPAR-γ蛋白表達均顯著升高(均P<0.01)；與模型組比較，沙苑子苷A低劑量、中劑量、高劑量組L02細胞ATGL、PPAR-α、PPAR-γ蛋白表達均顯著升高(P<0.05，P<0.01)。與對照組比較，模型組L02細胞TNF-α、IL-6蛋白表達均顯著升高(均P<0.01)；與模型組比較，沙苑子苷A低劑量、中劑量、高劑量組L02細胞TNF-α、IL-6蛋白表達均顯著降低(均P<0.01)。見表4，圖3。

表4 沙苑子苷A對TG代謝相關(guān)蛋白表達的影響

圖3 不同濃度沙苑子苷A對TG代謝相關(guān)蛋白表達的影響

3 討論

對沙苑子黃酮類成分的研究起源于20世紀80年代，陳妙華和劉風(fēng)山[11]首次提取出沙苑子特有黃酮成分，命名為沙苑子苷。目前已經(jīng)從沙苑子中提取到超過16種的黃酮類化合物[6，12]，如沙苑子苷A、沙苑子苷B、沙苑子苷C、沙苑子楊梅苷等。目前國內(nèi)外學(xué)者對沙苑子總黃酮的藥理作用研究較多，但是對單體成分的藥理研究還未見報道。課題組前期研究用1 mmol/L游離脂肪酸混合物(油酸:棕櫚酸為2:1)作用于人肝細胞L02細胞24 h建立了脂肪變肝細胞模型，本實驗利用此模型觀察沙苑子苷A對脂肪變L02細胞的影響，探討其降脂作用及分子機制。

肝臟參與脂質(zhì)代謝過程中的多個重要環(huán)節(jié)，攝取及合成脂肪酸，加工、貯存、氧化分解及輸出脂質(zhì)，當(dāng)肝臟獲得脂肪酸的量超過其處理能力時，就會造成脂肪沉積[13]。本實驗結(jié)果顯示FFA模型組L02細胞脂肪堆積明顯增加，TG、TC含量升高，MDA含量升高，SOD活性下降，細胞凋亡率增加，給予沙苑子苷A能顯著減少脂肪堆積，降低TG、TC、MDA含量，增加SOD活性，降低細胞凋亡率，減輕脂毒性造成的肝細胞損傷。說明沙苑子苷A是沙苑子降脂保肝的有效單體成分之一。

ATGL是機體脂質(zhì)代謝過程中的重要脂肪酶之一，是TG水解的第一步，主要把TG分解成甘油二酯，除在脂肪組織高表達外，ATGL也在骨骼肌、心肌、肝臟等非脂肪細胞中表達[14]。研究發(fā)現(xiàn)其不僅在脂肪組織脂解過程中處于關(guān)鍵脂肪酶的角色，而且在非脂肪組織的脂質(zhì)和能量代謝過程中也發(fā)揮了重要的作用[15]。盡管肝臟中ATGL的表達與脂肪組織相比較低，但是已經(jīng)證明ATGL是主要的肝臟TG水解酶，Ong等[16]研究顯示，由腺病毒介導(dǎo)的肝臟ATGL基因敲除小鼠體內(nèi)出現(xiàn)肝脂肪變性，原代肝細胞內(nèi)TG降解速率也受到抑制；與此同時，還發(fā)現(xiàn)ATGL過表達小鼠體內(nèi)脂肪酸氧化增加，改善肝臟的脂質(zhì)代謝[17]。本實驗研究顯示，F(xiàn)FA誘導(dǎo)L02細胞中ATGL的mRNA和蛋白的表達量比正常細胞中有明顯的提高，這說明了當(dāng)肝細胞中內(nèi)積累了大量TG時，細胞中脂肪分解限速酶ATGL的表達大量增加，細胞通過自身調(diào)節(jié)來代謝TG，使細胞恢復(fù)正常，給予沙苑子苷A能使細胞內(nèi)ATGL mRNA和蛋白表達量進一步提高。

PPARs是調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝核受體家族轉(zhuǎn)錄因子之一，PPARs有3種亞型：PPARα，PPARβ/δ和PPARγ[18]。其中PPARα在肝臟中高度表達，PPARα的激活在TG的合成以及氧化等代謝途徑發(fā)揮重要作用[19]。PPARγ在脂肪中過表達，促進脂肪細胞分化代謝[20]，但是研究發(fā)現(xiàn)，高脂血癥模型大鼠肝臟的PPARγ的蛋白表達水平顯著降低[21]，非酒精性脂肪肝患者經(jīng)過降脂藥非諾貝特治療后，觀察組肝組織PPARγ2 mRNA水平顯著高于對照組，說明非諾貝特可能通過提高肝組織PPARγ2表達，使脂肪從肝臟轉(zhuǎn)移并消耗[22]。ATGL的過表達可以提高PPARα的活性，激活PPARα信號通路和脂肪酸通道，進而促進脂質(zhì)代謝[23]。在ATGL缺陷型小鼠中，可以通過用PPARα激動劑治療來恢復(fù)缺陷的PPARα活化[24-25]。用PPARγ激動劑羅格列酮飼喂小鼠，其ATGL mRNA和蛋白表達都顯著增加,通過對ATGL基因啟動子的分析證明ATGL受PPARγ的直接調(diào)控[26]。本實驗研究顯示，F(xiàn)FA誘導(dǎo)L02細胞中PPARα、PPARγ的mRNA和蛋白表達量比正常細胞中有明顯的提高，這說明了當(dāng)肝細胞中積累了大量TG時，細胞中PPARα、PPARγ的表達會自行上調(diào)，細胞自動調(diào)節(jié)來分解TG使細胞恢復(fù)正常，給予沙苑子苷A會使細胞內(nèi)PPARα、PPARγ表達量進一步提高，PPARα的上調(diào)幅度比PPARγ的幅度略小。說明沙苑子苷A可能通過上調(diào)PPARα、PPARγ的mRNA和蛋白的表達，使ATGL表達增加，促進肝臟TG的水解，減輕肝臟脂肪的沉積。

TNF-α和IL-6是2個與肝臟脂肪沉積關(guān)系密切的細胞因子，與肝組織的炎癥、壞死和纖維化正相關(guān)[27]。Stienstra等[28]研究發(fā)現(xiàn)PPAR-α基因敲除小鼠和野生型小鼠用高脂飲食喂養(yǎng)6個月后，PPAR-α基因敲除小鼠中IL-6、TNF-α等多種炎癥介質(zhì)的表達比野生型小鼠顯著升高。PPARγ通過降低基質(zhì)金屬蛋白酶9的活性，抑制炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6以及TNF-α的表達[29]。本實驗研究顯示，F(xiàn)FA誘導(dǎo)L02細胞中IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白表達量比正常細胞中有明顯的提高，這說明了當(dāng)肝細胞中脂肪大量沉積會造成細胞受損，引起細胞的炎癥反應(yīng)，給予沙苑子苷會使細胞內(nèi)的IL-6和TNF-α表達顯著降低，說明沙苑子苷A能減輕脂肪變性肝細胞的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究從體外實驗證實沙苑子苷A是沙苑子降脂的有效單體成分之一，其可能通過上調(diào)PPARα、PPARγ的表達，使ATGL表達增加，促進肝臟TG的水解，減少肝臟脂肪的沉積，緩解氧化應(yīng)激，降低促炎TNF-α和IL-6的分泌，減輕炎癥反應(yīng)，從而恢復(fù)肝細胞的正常功能。