基于網絡藥理學探討玉屏風散治療肝細胞癌的作用機制

金 虹 龐雪瑩 劉松江

(1 黑龍江中醫藥大學，哈爾濱，150040； 2 黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，哈爾濱，150040)

肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)為全球第6大常見癌癥，約占原發性肝癌的80%，目前已是我國第4位的常見惡性腫瘤及第3位的腫瘤致死病因[1]，給患者帶來了巨大的生理及心理雙重壓力，同時加重了社會的經濟壓力。肝癌在中醫學上可歸屬于積聚、癥瘕、臌脹范疇。《中藏經》曾言道：“積聚癥瘕雜蟲者，皆五臟六腑真氣失而邪氣并。”HCC的發病原因多因正氣不足所致，氣虛無以行血，最終導致肝血因瘀而不通，長期可致肝體失于濡養，造成氣滯血瘀于內，故而形成癥瘕積聚，終發為肝癌[2]。在臨床中由于早期診斷方法不足且HCC發病隱匿，導致多數患者在最終臨床確診時已屬于中晚期，喪失手術機會，現臨床實踐提示經導管動脈栓塞化療(Transcatheter Arterial Chemoembolization，TACE)可有效延長患者生存期，但術后仍常出現疼痛、發熱、惡心等一系列不良反應[3]。

現代研究表明中藥在臨床上可整體調節機體狀態，具有療效可觀且不良反應小的特點，可通過多通路、多靶點等角度治療疾病[4]，故HCC的臨床診療模式正逐漸向中西醫結合治療轉變。正氣不足為中醫學總結得出的HCC發病的主要原因，玉屏風散作為中醫學中扶正固表的經典名方，不但可增強機體免疫力[5]，還可調節機體產生抗腫瘤的作用[6]。方中所涉及的黃芪、防風、白術均為臨床治療HCC中的常用藥[7]。現代研究表明，黃芪不但具有抗腫瘤作用，還具有調節機體免疫功能和抗氧化等作用[8]，白術具有促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖、提高對腫瘤細胞的細胞毒性和抑制腫瘤組織的侵襲能力等作用[9]，防風在研究中表明其具有抗炎，抗氧化及抗腫瘤等作用[10]。因此可推測玉屏風散存在治療HCC的潛在作用靶點及機制。

采用網絡藥理學研究方法可從系統層面揭示中藥對機體調控的作用，所構建的“藥物-成分-疾病”的靶點網絡圖作為一種新的研究思路，突破了單一靶點，單一途徑的藥物研究束縛，其獨有的系統性、整體性與中醫藥研究的理念契合[11-12]。本文借助網絡藥理學的研究手段，探討了玉屏風散治療HCC的作用機制，為今后使用玉屏風散治療HCC的臨床及實驗研究提供了新的探索思路及方向。

1 資料與方法

1.1 獲取與篩選玉屏風散的活性成分 將玉屏風散中所含藥物，即黃芪、防風及白術在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://tcmspw.com.php)中進行檢索。將篩選標準設置為口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%，類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18，篩選出有效成分后，將玉屏風散活性成分的靶基因通過TCMSP進行預測，使用UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)將獲得的靶點進行基因標準化處理，去除重復值。

1.2 獲取疾病靶點 以“Hepatocellular Carcinoma”作為關鍵詞在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)中進行搜索，將檢索到的蛋白通過UniProt數據庫進行基因標準化處理。

1.3 構建“藥物-疾病-成分-靶點”網絡圖 篩選玉屏風散活性成分的靶基因與疾病基因的共同基因，繪制韋恩圖并導入Cytoscape 3.7.2軟件中以形成“藥物-疾病-成分-靶點”的網絡圖，其中的節點(Node)代表了藥物的活性成分、關鍵靶基因及HCC等，邊(Edge)則代表點與點的作用關系。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡的構建 使用STRING數據庫(http://string-db.org)，將選項中的物種定義為“Homo sapiens”，以構建玉屏風散治療HCC核心靶點的蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網絡，再將以上所得數據導入至Cytoscape 3.7.2中，利用“Network Analyze”從而進行網絡拓撲的參數分析，并設置Degree值大于平均值(≥11)作為標準以進行篩選，最終得到核心靶點信息。

1.5 基因本體富集分析及京都基因和基因組百科全書富集分析 使用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數據庫將篩選出的PPI網絡核心靶點進行導入，將種屬選項定義為“Homo Sapiens”，再依次選取“GOTERM_BP_DIRECT”“GOTERM_CC_DIRECT”“GOTERM_MF_DIRECT”和“KEGG_PATHWAY”進行基因本體(Gene Ontology，GO)生物過程的富集分析和京都基因和基因組百科全書富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，設置篩選標準為P≤0.05，得到符合條件的前10條生物過程和KEGG通路，并用條形圖進行結果展示。

2 結果

2.1 篩選及預測藥物活性成分靶點 最終得到玉屏風散的活性成分對應靶點共92個，其中有效成分包括細胞腫瘤抗原p53(Cellular Tumor Antigen p53)、凋亡調節劑Bcl-2(Apoptosis Regulator Bcl-2)、血管內皮生長因子受體2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2)、白細胞介素-6(Interleukin-6)等。見表1。

表1 玉屏風散主要成分

續表1 玉屏風散主要成分

2.2 玉屏風散治療HCC的潛在作用靶點 藥物與疾病的韋恩圖得到交集靶點，即玉屏風散治療HCC的潛在靶點，共66個。見圖1。

圖1 藥物-疾病韋恩圖

2.3 “藥物-疾病-成分-靶點”網絡拓撲圖分析 構建的“藥物-疾病-成分-靶點”網絡圖中，紅色代表疾病及藥物，橙色、黃色、紫色分別代防風、黃芪、白術中有效成分所對應的節點，共51個，藍色代表玉屏風散有效成分及HCC所對應靶點，其平均自由度為10.38。見圖2。

圖2 “藥物-疾病-成分-靶點”網絡

2.4 篩選出核心靶點 構建的玉屏風散與HCC共同靶點的PPI網絡圖包括65個節點，328條邊。篩選出26個的核心靶點，即IL-6、TP53、TNF、NOS3、ESR1、JUN、PTGS2等。見圖3～4。

圖3 玉屏風散與HCC的共同靶點PPI網絡

圖4 玉屏風散治療HCC的核心靶點

2.5 GO富集分析結果 最終得到146個條目，各取前10個條目形成富集條形圖，其中主要涉及到RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、MAPK級聯反應的正調控及類固醇激素受體活性等。見圖5。

圖5 GO功能富集分析

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析共得到54個條目，取前10個制作富集條形圖，其中涉及癌癥信號通路、TNF信號通路及胰島素抵抗等通路。見圖6。

圖6 KEGG功能富集分析

3 討論

HCC雖有臨床治療措施，但5年生存率仍然較低[13]，中醫學認為HCC的發病機制主要歸結為正虛邪實，正虛以脾氣虛及肝腎不足為主，邪實則以氣滯血瘀為主，治療時應兼顧標本。在臨床中中藥可作用于疾病的各個發展環節，可整體調動機體的免疫功能，已有研究表明玉屏風在治療HCC的過程中具有增強抗腫瘤以及調節機體免疫力的功效[14-16]。方中以黃芪為君，在內可補脾肺，在外可固表，以白術為臣可益氣健脾，以上二藥相須為用，既可顧護衛表，又可令外邪難侵，另用防風為佐，既可祛風又可御風，三藥合用可顧護正氣且不留邪。方中黃芪為扶正固本之良藥，現代研究表明，其主要成分為黃芪多糖，不僅可以直接起到免疫調節及抗病的作用，還可以通過改善微生態從而起到間接的免疫調節作用[17]。防風的主要成分為原酮類及香豆素2類，其具有抗炎、抗驚厥、抗腫瘤及鎮痛等作用[18]。白術中含有苯丙烷、黃酮、固醇、苯醌和多糖等成分，具有善腸胃功能、抗氧化、抗腫瘤和保護肝臟等作用[19]。

本研究運用網絡數據挖掘的技術將玉屏風進行網絡藥理學分析，并篩選其有效成分與HCC的交集靶點，制作形成“藥物-疾病-成分-靶點”網絡拓撲圖，將關鍵靶點進行了生物通路的富集分析，結果表明玉屏風散治療HCC可能與IL-6、TP53、TNF、NOS3、ESR1、JUN、PTGS2等靶點有關。IL-6為一種細胞因子，其具有誘導B細胞分化，提高自然殺傷細胞活性，誘導急性期的反應并可刺激肝細胞，抑制細胞凋亡等作用。腫瘤壞死因子則是一種與炎癥反應相關的細胞因子[20]。腫瘤蛋白p53(Tumor Protein p53，TP53)作為一種抑癌蛋白，可以起到誘導細胞周期阻滯、凋亡及衰老的作用，也可參與DNA的修復或代謝改變[21]。一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase，NOS)為一種異構酶，其中NOS3主要作用為增加血管通透性及調節血管擴張度[22]。前列腺素內過氧化物合酶(Prostaglandin-endoperoxide Synthase，PTGS)2為PTGS誘導型，其參與了HCC的病情進展全過程，其在肝癌組織表達陽性并在進展期肝癌組織中高表達，與血管內皮生長因子正相關，其特異性抑制劑可抑制肝癌細胞增殖并誘導細胞凋亡[23]。促癌蛋白c-Jun氨基端蛋白激酶可以通過結合轉錄啟動區域的方式調控相關蛋白表達，構成促癌信號環路[24]。根據網絡途中結果顯示可知β-谷甾醇、黃芩素、原酮類、甜菜堿、異紫花前胡內酯、5-O-甲基維斯阿米醇、珊瑚菜素所涉及共有靶點最多，這些成分可能參與了玉屏風散治療HCC的過程。另外本研究還通過GO富集分析及KEGG生物通路富集分析中看出，使用玉屏風散治療HCC的主要靶點涉及細胞核、與RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogenactivated Protein Kinase，MAPK)級聯反應的正調控、類固醇激素受體活性以及TNF信號通路等，其中與細胞核相關的靶點最多。

綜上所述，玉屏風散治療HCC具有多通路、多靶點、多成分的特點，本研究對可能涉及的機制進行了分析研究，為玉屏風散治療HCC提供了新思路。但網絡藥理學分析的結果僅提示玉屏風散與HCC的相關性，且受限于數據庫的完整性，故而仍需要后續深入研究以進一步考察。