四氯化碳致小鼠急性肝損傷模型建立與考察

付雙楠 高達 郭佳佳 苗明三 朱平生 宮嫚

急性肝損傷(Acute liver injury, ALI)是一種常見的肝臟疾病，由不同的致病因素引起，包括病毒感染、酒精攝入、藥物和化學毒物等，導致氧化應激、炎癥、肝細胞壞死和凋亡等多種病理改變[1]，嚴重或持續性損傷會導致肝衰竭、肝硬化甚至肝癌。全球每年約有200萬人死于肝病，肝硬化目前是全球第11位最常見的死因，肝癌是第 16 位最常見的死因，二者共占全球所有死亡人數的3.5%[2]。四氯化碳(Carbon tetrachloride, CCL4)所致肝損傷模型是常用的急性肝損傷模型，有研究表明，經腹腔注射濃度為0.1% CCL4溶液即可引起ALI[3]，但對最佳染毒時間尚無明確標準。本研究通過對小鼠單次腹腔注射0.1% 濃度的CCL4橄欖油溶液制備急性肝損傷模型并檢測生化水平，探索最佳染毒時間，以確定穩定的小鼠急性肝損傷模型，同時聯合聯苯雙酯灌胃，為下一步臨床治療及保肝藥物等研究提供參考依據。

資料與方法

一、動物

昆明系(KM)小鼠，SPF級，雌雄各半，18～22 g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，生產許可證號：SCXK(魯) 20140007，實驗動物使用許可證號：SYXK(豫) 2015-0005。實驗期間自由飲水、攝食。本實驗獲得河南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準。

二、 試劑

丙氨酸氨基轉移酶(ALT) 試劑盒(批號：D1507053，上海復星長征醫學科學有限公司)；天冬氨酸氨基轉移酶( AST) 試劑盒(批號：D1507073，上海復星長征醫學科學有限公司)。聯苯雙酯(批號：020141140，萬邦德制藥集團股份有限公司)。CCL4(批號：20151002，天津市富宇精細化工有限公司)；橄欖油(批號：H08J6P1314，上海源葉生物科技有限公司)。

三、儀器設備

日本奧林巴斯AU400全自動生化分析儀，日本奧林巴斯公司；Cytation3細胞成像酶標儀，美國伯騰公司；GL-16G臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；YP1201N 型電子天平[舜宇恒平( 上海) 科學儀器有限公司]；可調式移液槍，上海雷勃分析儀器有限公司；Leica DMI4000B智能型倒置熒光顯微鏡，德國徠卡( Leica) 儀器有限公司。

四、方法

(一)0.1%CCL4建模后不同時間點的ALT、AST變化及聯苯雙酯的保護作用 KM小鼠96只，SPF級，體質量范圍在18～22 g，雌雄各半，隨機分為12組，即3、6、12和24 h，4個時間點的空白對照組、模型組以及聯苯雙酯組。所有小鼠適應性喂養7 d，期間自由飲水、攝食，第8天開始聯苯雙酯組以5.625 mg/kg灌胃，空白對照組及模型組灌胃等劑量蒸餾水，每天1次，連續灌胃7 d；第15天腹腔注射0.1%濃度CCL4橄欖油溶液制備急性肝損傷模型，分別于造模后3、6、12和24 h后處理各組動物，以10%水合氯醛按0.03 mL/10 g麻醉動物，摘眼球取血，4 ℃，4 000 r/min離心15 min，取血清，采用全自動生化分析儀測各組生化指標ALT及AST。

(二)0.1%CCL4建模后不同時間點的肝臟指數變化 將麻醉后的各組動物收集完血清后，摘取肝臟，置于錫箔紙上稱量肝臟體質量，并計算肝臟指數。計算公式：肝濕重/鼠重×100%。

(三)0.1%CCL4建模后不同時間點的肝組織病理變化 取肝左中葉一小塊組織，用10%甲醛固定，經脫水、透明、石蠟包埋、切片和脫蠟后常規HE染色，光鏡下進行肝組織病理學檢查。

五、統計方法

應用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析。計量資料采用均數 ± 標準差(s)表示，多組間比較采用單因素方差法，方差不齊時用Dunnett’s方法分析。以P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、0.1%CCL4建模后不同時間點ALT、AST的變化

與空白組比較，3、6、12和24 h模型組ALT、AST數值升高(P<0.01)；與模型組相比，3、6、12、24 h聯苯雙酯組ALT、AST數值均有降低(P<0.01)。見表1。

表1 0.1%CCL4建模后不同時間點對ALT、AST的影響(s，n=8)

二、 0.1%CCL4建模后不同時間點的肝臟指數變化

與空白對照組比較，模型制備成功后3、6、12和24 h模型組肝臟指數升高(P<0.01)，隨著建模時間增加，肝臟指數逐漸升高，體質量呈下降趨勢，其中小鼠體質量在12和24 h變化顯著(P<0.05)。與模型組比較，隨著建模時間增加，聯苯雙酯組肝臟指數均下降，6、12和24 h肝臟指數下降明顯(P<0.01)。見表2。

表2 0.1%CCL4建模后不同時間點的肝臟指數變化(s，n=8)

三、0.1%CCL4建模后不同時間點的肝組織病理變化

光鏡下觀察可見，各時間點空白對照組小鼠肝細胞未見異常病理變化，肝細胞索呈放射狀排列。3 h模型組可見少量腫脹肝細胞；6 h模型組肝細胞腫脹明顯增多；12 h模型組可見大量肝細胞腫脹，并出現少量炎細胞浸潤；24 h模型組小鼠大多數肝細胞腫脹，可見肝細胞壞死，肝索排列紊亂，并出現明顯的炎細胞浸潤現象。24 h聯苯雙酯組小鼠較24 h模型組小鼠肝細胞腫脹量少，偶見點狀死，匯管區炎細胞浸潤有所好轉。見圖1。

圖1 小鼠肝損傷病理檢查結果(HE×200)

討 論

肝損傷是多種肝臟疾病的病理基礎，其機制多與肝細胞凋亡[4]、炎性因子產生[5]、脂質過氧化[6]和氧化應激[7]等相關。復制穩定的肝損傷模型能夠為臨床診斷、治療肝損傷及保肝藥物研究提供幫助。CCL4所致肝損傷模型是常用的實驗性肝損傷模型，是護肝藥物作用及機制研究的經典病理模型，重復性較好[8]。CCL4進入機體后能夠導致脂質過氧化、膜損傷，從而導致肝細胞損傷[9]。為避免長時間、高濃度CCL4溶液刺激引起肝纖維化、肝硬化、肝衰竭等嚴重的肝損傷，本實驗選取0.1%濃度的CCL4溶液制備急性肝損傷模型，探索不同時間點肝損傷程度的變化，旨在選擇最佳造模方式。

ALT和AST在肝損傷診斷中是兩種重要的生化指標，被作為判定肝損傷的標志物[10]， 當肝臟受到損傷時，肝細胞內各種酶如 ALT、AST會大量釋放進入血液當中，因此當兩者呈高水平狀態時表示機體存在一定程度的肝損傷[11]。本實驗中與空白組比較，模型組與聯苯雙酯組在3、6、12、24 h轉氨酶水平均有升高，提示肝損傷的發生，也同時證實模型制備成功。

實驗結果顯示，模型組染毒后，ALT在3 h輕度升高，12、24 h升高明顯；AST在3、6、12、24 h均升高，但在12和24 h升高顯著；肝臟指數在3、6 h輕度升高，12及24 h升高明顯；肝臟病理變化在 12及24 h可見明顯的肝細胞腫脹和炎性細胞浸潤，24 h損傷程度更顯著，因此，筆者認為0.1%CCL4溶液制備肝損傷模型時，由于3和6 h時間短，模型不穩定，而24 h之后損傷程度較重易造成重癥肝損傷，因此在12～24 h 之間建模更適宜。有學者統計，目前CCL4制備小鼠急性肝損傷模型的實驗中，造模時間最常見的為24 h(占30.28%)、16 h(占27.23%)、18 h(占9.16%)、20 h(占5.85%)、12 h(占5.09%)，多在12～24 h之間，因此階段處于肝損傷峰值期[12]，與本實驗建議時間相符合，造模時間太長及太短均不利于模型的穩定性。

聯苯雙酯在臨床中有降低轉氨酶、保護肝細胞的功效，在實驗中經常被作為研究保肝藥物的陽性對照物，為中藥五味子的提取物，有研究表明，南、北五味子的醇提物、水提物、木脂素單體類成分、多糖類成分等具有顯著的保護肝細胞、降低轉氨酶的功效[13]，本實驗結果也顯示，聯苯雙酯能夠降低ALT及AST、肝臟指數以及減少肝臟腫脹、抑制肝臟炎癥，從而發揮保肝的作用。在保肝藥物的研究中，中草藥是不可或缺的一部分，目前已有多項研究表明中藥單味藥、中藥單味藥衍生物、單味藥提取物及中藥復方等對肝損傷有保護作用，如益智仁及其衍生物[14]，蘆根多糖、蘆根果膠和蘆根提取物[15]，白頭翁皂苷[16]，王不留行炭納米類成分[17]等。中醫藥是我國的瑰寶，在今后的實驗中加強對中草藥、中藥復方等的研究，使其在臨床治療肝損傷中發揮重要的作用是很有必要的。