慢性肝病常用動物模型及建模方案

朱雪晶 王夢婷 鄢和新 黃仁杰

各種肝病患者超過4億，大部分是由于病毒感染、酗酒和代謝性因素造成的慢性肝損傷，有700萬肝病患者發展為肝硬化，最終每年有超過40萬例死于終末期肝病[1, 2]。構建成模性高、重復性好的動物肝損傷模型對于慢性肝病的研究十分重要。本研究比較幾種常見慢性肝損傷動物模型的穩定構建方法及其表現特點，為肝病研究提供依據。

材料與方法

一、小鼠NASH模型

(一)實驗動物 SPF級C57BL/6小鼠72只，雄性，4～6周齡，購于上海靈暢生物科技有限公司(合格證號：20180003011435)，飼養于上海南方模式生物科技股份有限公司動物房[使用許可證號：SYXK(滬)2018-0002]。

(二)實驗飼料 購于美國RESEARCH DIETS公司，批號20030567A2，飼料為45%脂肪熱量和0.1%蛋氨酸且不含膽堿的改良高脂飼料。

(三)方法 動物適應性飼養至體質量>20 g，適應期使用普通飼料喂養。更換改良高脂飼料前一晚禁食8～12 h。第2天選取體質量較大的64只小鼠使用改良高脂飼料喂養[3, 4]，剩余8只小鼠使用普通飼料喂養。喂養至2周時，所有小鼠通過眼眶靜脈叢取血，分離上清，并隨機處死46只改良高脂飼料喂養的小鼠，觀察其肝臟病變；剩余動物繼續使用和之前相同的飼料喂養至4周處死并取材[5, 6]。

二、小鼠肝纖維化模型

(一)實驗動物 SPF級C57BL/6小鼠60只，雄性，6～7周齡，購于上海靈暢生物科技有限公司(合格證號：20180003008821)，飼養于上海南方模式生物科技股份有限公司動物房[使用許可證號：SYXK(滬)2018-0002]，適應環境7 d。

(二)方法 隨機選取52只小鼠按2 mL/kg腹腔注射10% CCL4(國藥集團化學試劑有限公司，批號20191113)橄欖油溶液，每周3次，連續12周[7-10]；剩余8只小鼠在相同的時間注射同體積的橄欖油。誘導至12周時，所有小鼠通過眼眶靜脈叢取血，分離上清，并隨機處死34只注射CCL4的小鼠，剩余動物停止誘導2周后處死并取材。

三、大鼠肝硬化模型

(一)實驗動物 SPF級SD大鼠45只，雄性，6周齡，購于浙江維通利華實驗動物技術有限公司(合格證號：20201105Aazz0619000504)，飼養于上海南方模式生物科技股份有限公司動物房[使用許可證號：SYXK(滬)2018-0002]，適應環境7 d。

(二)方法 隨機選取37只大鼠腹腔注射TAA(Sigma，批號BCBZ6865)200 mg/kg，每周2次，連續16周[11, 12]；剩余8只大鼠在相同的時間注射同體積的0.9% NaCl。誘導至16周時，所有大鼠通過眼眶靜脈叢取血，分離上清，并隨機處死5只注射TAA的大鼠，檢測其肝臟病變；剩余動物停止誘導4周后處死并取材。

四、主要設備

全自動生化分析儀(德國西門子公司，型號2400)，電子天平(上海然浩公司，型號ZG-TP203)，高速臺式冷凍離心機(長沙湘儀公司，型號HT150R)。

五、統計學處理

結 果

一、小鼠非酒精性脂肪性肝炎模型

(一)體質量 普通飼料組小鼠體質量呈正常增長，而改良高脂飼料組小鼠體質量略有下降，第2、3、4周體質量顯著小于普通飼料組小鼠，且差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 普通飼料組和改良高脂飼料組體質量變化

(二)血清ALT、AST、LDH、TC、TG水平 改良高脂飼料組小鼠2周時血清中ALT、AST、LDH水平相比普通飼料組小鼠升高，TC、TG水平降低，且差異有統計學意義(均P<0.01)，見表2。改良高脂飼料組小鼠4周時血清中ALT、AST、LDH水平相比普通飼料組小鼠升高，TC、TG水平降低，且差異有統計學意義(P<0.01)，見表3。改良高脂飼料組小鼠誘導4周與喂養2周相比，血清中ALT、AST水平無明顯差異， LDH顯著升高，TC、TG則顯著降低，且差異有統計學意義(P<0.01)，見表4。

表2 普通飼料組和改良高脂飼料組誘導2周血清ALT、AST、LDH、TC、TG水平比較(±s)

表3 普通飼料組和改良高脂飼料組誘導4周血清ALT、AST、LDH、TC、TG水平比較(±s)

表4 改良高脂飼料組誘導2周和4周血清ALT、AST、LDH、TC、TG水平比較(±s)

(三)肝組織病理 普通飼料組小鼠肝臟外觀正常，色澤紅潤，病理學染色顯示其結構正常，肝索圍繞中央靜脈呈放射狀排列，胞核呈卵圓形。改良高脂飼料組小鼠肝臟外觀顏色偏黃，2周時病理染色可見肝組織空泡樣病變，空泡內充滿脂滴；4周時可見肝細胞脂肪變性面積增大，見圖1。

注：A為普通飼料組小鼠肝臟外觀；B為普通飼料組小鼠肝組織HE染色；C為普通飼料組小鼠肝組織油紅O染色；D為改良高脂飼料組小鼠喂養2周肝臟外觀；E為改良高脂飼料組小鼠喂養2周肝組織HE染色；F為改良高脂飼料組小鼠喂養2周肝組織油紅O染色；G為改良高脂飼料組小鼠喂養4周肝臟外觀；H為改良高脂飼料組小鼠喂養4周肝組織HE染色；I為改良高脂飼料組小鼠喂養4周肝組織油紅O染色

二、小鼠肝纖維化模型

(一)體質量 橄欖油組小鼠體質量呈正常增長，而CCL4組小鼠體質量增長相對稍緩，見圖2。

圖2 橄欖油組和CCL4組誘導期間小鼠的體質量變化

(二)血清ALT、AST水平 CCL4組小鼠12周后血清中ALT、AST分別為(8507.3±1083.1)和(4911.2±644.0)U/L，同時期橄欖油組小鼠分別為(41.8 ± 29.2)和(104.0 ± 33.6)U/L，差異有統計學意義(t=21.85、20.86，均P<0.01)。停藥2周后ALT、AST迅速下降，但CCL4組小鼠血清中ALT、AST水平為(41.7 ± 7.7)和(70.8 ± 30.0)U/L，仍高于橄欖油組小鼠的(23.8 ± 4.4)和(38.8 ± 5.2)U/L(t=6.125、2.976，均P<0.01)。

(三)肝組織外觀與病理 橄欖油組小鼠肝臟表面光滑，病理顯示其結構正常，肝索圍繞中央靜脈呈放射狀排列，胞核呈卵圓形。CCL4組小鼠肝臟表面粗糙，病理顯示靜脈周圍大灶狀炎細胞浸潤，正常肝小葉結構被破壞，纖維組織間隔形成大小不等的假小葉。注射CCL412周，肝纖維化模型成功率100%(70/70)，停止注射CCL4后，肝纖維化模型至少可維持2周，見圖3。

注：A為橄欖油組小鼠肝臟外觀；B為橄欖油組小鼠肝組織HE染色；C為橄欖油組小鼠肝組織SR染色；D為CCL4組小鼠肝臟外觀；E為CCL4組小鼠肝組織HE染色；F為CCL4組小鼠肝組織SR染色；G為CCL4組小鼠停藥2周肝臟外觀；H為 CCL4組小鼠停藥2周肝組織HE染色；I為 CCL4組小鼠停藥2周肝組織SR染色

三、大鼠肝硬化模型

(一)體質量 0.9% NaCl組大鼠體質量呈正常增長，而TAA組大鼠體質量增長相對較緩，見圖4。

圖4 0.9% NaCl組和TAA組誘導期間大鼠的體質量變化

(二)血清ALT、AST、GGT、GPDA、Alb水平 TAA組大鼠16周后血清中ALT、AST、GGT、GPDA水平相比同時期0.9% NaCl組大鼠升高，Alb水平降低，且差異均有統計學意義(均P<0.05)， 見表5。停藥4周后ALT、AST、GPDA迅速下降，GGT、Alb水平略有升高，但TAA組大鼠血清中ALT、AST、GGT水平還是顯著高于0.9% NaCl組，且差異均有統計學意義(均P<0.05)，見表6。

表5 0.9% NaCl組和TAA組誘導16周，血清ALT、AST、GGT、GPDA、Alb水平比較(±s)

表6 0.9% NaCl組和TAA組停藥4周，血清ALT、AST、GGT、GPDA、Alb水平比較(±s)

(三)肝組織外觀與病理 0.9% NaCl組大鼠肝臟表面光滑，病理顯示其結構正常，肝索圍繞中央靜脈呈放射狀排列，胞核呈卵圓形。TAA組大鼠肝臟表面粗糙，大小結節混雜，正常肝小葉結構被破壞纖維組織間隔形成大小不等的假小葉，纖維間隔增寬。注射TAA 16周，誘導肝硬化模型成功率100%(37/37)，停止注射TAA后，肝硬化模型至少可維持4周，見圖5。

注：A為0.9% NaCl組大鼠肝臟外觀；B為0.9% NaCl組大鼠肝組織HE染色；C為0.9% NaCl組大鼠肝組織SR染色；D為TAA組大鼠肝臟外觀；E為TAA組大鼠肝組織HE染色；F為TAA組大鼠肝組織SR染色；G為TAA組大鼠停藥4周肝臟外觀；H為 TAA組大鼠停藥4周肝組織HE染色；I為 TAA組大鼠停藥4周肝組織SR染色

討 論

慢性肝損傷動物模型一般選擇嚙齒類的大鼠或小鼠，這類動物遺傳背景清晰，個體間差異小，可控性和經濟性都比較有優勢。本研究中改良高脂、CCL4、TAA誘導的慢性肝損傷模型均為可逆模型，停止誘導一段時間后，由于大、小鼠肝臟本身強大的再生功能，轉氨酶迅速下降，肝臟逐漸恢復。故轉氨酶的升高水平并不能代表肝損傷的程度，肝損傷嚴重程度需結合病理學。

改良高脂飼料誘導的NASH模型選擇C57小鼠是由于小鼠對飼料的消耗相對較小，該模型的建立需要不間斷使用改良高脂飼料，連續喂養2周即可快速建立NASH模型，ALT、AST、LDH水平上升4～7倍，成模率100%，繼續喂養至4周，模型進一步加重。該模型動物體質量、TG、TC水平雖然有別于臨床NASH患者，但是肝組織的脂肪變性以及轉氨酶的升高可以很好的模擬臨床NASH疾病。

CCL4是常用的肝損傷毒物之一，CCL4經P450酶代謝激活，生成活自由基及一系列氧化活性物質，與肝細胞質膜或亞細胞膜脂質發生過氧化反應，連續注射小劑量的CCL4可致肝纖維化，該模型選擇C57小鼠，是由于該品系的小鼠對于CCL4的耐受性較好，可以長期反復注射。本研究使用的誘導條件，肝纖維化誘導成功率可達100%，且個體均一，去病因后AST、ALT約升高2倍，模型至少可以維持2周。該模型可以很好的模擬臨床肝纖維化患者的病癥。

TAA常用于肝硬化模型的誘導，TAA被肝臟攝取后，經肝細胞內的P450酶代謝為TAA-硫氧化物，引起脂質過氧化反應和肝細胞損傷，并可致腸道菌群死亡產生內源性內毒素，進一步加重肝損傷。由于小鼠肝臟不會形成肝硬化結節的外觀表現，故選用大鼠來建立肝硬化模型，TAA誘導的肝硬化模型與臨床肝硬化患者的肝臟外觀類似。本研究使用的誘導條件，肝硬化誘導成功率可達100%。去病因后ALT、AST、GGT、GPDA這些指標上升不明顯，但經解剖觀察，注射了TAA的大鼠肝臟表面都有結節形成，但是個體間存在一定的差異性，主要表現為大小結節的占比不同。

本研究比較了三種常用的慢性肝損傷模型建模方法，模型成功率高、表型穩定，適用于慢性肝病機制以及藥效學研究。