肝細胞核因子1α在慢性乙型肝炎患者肝組織中的表達及意義

尤莉，王瑞，侯丹

肝細胞核因子1α在慢性乙型肝炎患者肝組織中的表達及意義

尤莉1，王瑞2，侯丹1

1 北部戰區總醫院健康醫學科，沈陽 110001；2 牡丹江市第二人民醫院肝病治療中心

探討慢性乙型肝炎（CHB）患者肝組織肝細胞核因子1α（HNF-1α）的表達及意義。選取72例CHB患者（CHB組），用彈射式組織活檢槍取肝組織。另選取35例慢性HBV攜帶者肝組織標本（HBV攜帶組）和肝血管瘤旁正常肝組織（正常組）。采集各組血液標本，檢測ALT、AST、總膽紅素（TB）、HBV-DNA；用Western blotting法檢測肝組織HNF-1α蛋白表達；ELISA法檢測肝組織炎癥因子白細胞介素（IL）-1β、IL-6和腫瘤壞死因子α（TNF-α）。HNF-1α蛋白表達與炎癥因子的關系用Pearson分析；用受試者工作特征（ROC）曲線分析HNF-1α診斷CHB的價值，計算曲線下面積（）、靈敏度和特異度。CHB組ALT、AST、TB水平均高于HBV攜帶組和正常組（均<0.05），CHB組HBV-DNA水平高于HBV攜帶組（<0.05）。CHB組HNF-1α蛋白表達均低于HBV攜帶組和正常組（均<0.05）。CHB組IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達均高于HBV攜帶組和正常組（均<0.05）。CHB患者HNF-1α蛋白表達與IL-1β、IL-6、TNF-α均呈負相關（分別為-0.309、-0.273、-0.241，均<0.05）。ROC曲線分析顯示，HNF-1α蛋白表達<1.165時診斷CHB的價值最高，為0.942（95%：0.895～0.989，<0.001），靈敏度和特異度分別為94.29%和84.72%。炎癥分級G1級、G2級、G3級、G4級CHB患者HNF-1α蛋白表達比較差異有統計學意義（=4.632，<0.05），分級越高，蛋白表達越低。纖維化分期S1期、S2期、S3期、S4期HNF-1α蛋白表達比較差異有統計學意義（=3.199，<0.05），分期越高，蛋白表達越低。CHB患者肝組織HNF-1α表達與炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α呈負相關，HNF-1α可能參與CHB的發生、發展。

慢性乙型肝炎；炎癥因子；肝細胞核因子1α；纖維化

乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性流行，我國慢性HBV感染者約有7 000萬例，其中慢性乙型肝炎（CHB）患者2 000萬～3 000萬例［1］。HBV感染可造成肝損傷，促使肝臟纖維化形成，最終可進展為肝硬化（CL）甚至肝癌［2-4］。研究顯示，HBV并不是直接對肝細胞造成損傷，而是引起機體免疫炎癥損傷后導致肝細胞損傷［1］。HBV感染后引起免疫損傷的機制復雜，目前尚未完全明確。肝細胞核因子1α（HNF-1α）是肝細胞核因子家族的主要成員之一，可以調控諸多肝功能基因表達，在肝臟發育和維護肝細胞功能方面有重要作用［5］。HNF-1α與CHB的關系既往少有報道。研究顯示，HNF-1α與免疫炎癥損傷密切相關［6-8］。有研究發現，HNF-1α通過轉錄因子κB（NF-κB）而抑制HBV的表達及復制［8］，而NF-κB信號通路又是免疫炎癥損傷中的一條重要通路，因此推測HNF-1α可能通過介導免疫炎癥損傷而參與HBV感染后病情進展。本研究以CHB患者為研究對象，用Western blotting法檢測肝組織HNF-1α表達，用ELISA檢測炎癥因子白細胞介素（IL）-1β、IL-6和腫瘤壞死因子α（TNF-α）表達，分析HNF-1α與肝臟纖維化和炎癥的關系，以期探討HNF-1α在CHB發生、發展中的作用。

1 資料與方法

1.1臨床資料選取2018年1月—2021年9月牡丹江市第二人民醫院收治的CHB患者72例（CHB組），其中男51例、女21例，年齡（36.34 ± 4.28）歲，BMI（24.78 ± 3.12）kg/m2。病理炎癥分級［9］：G1級24例、G2級22例、G3級14例、G4級12例；纖維化分期［9］：S1期18例，S2期18例，S3期20例，S4期16例。納入標準：①符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015更新版）》診斷標準［10］；②年齡≥18歲；③臨床資料完整。排除標準：①其他肝炎病毒感染；②酒精性肝病；③脂肪肝；④自身免疫性肝?。虎菟幬镄愿窝祝虎奕焉锲诤筒溉槠趮D女。另選取35例慢性HBV攜帶者肝組織標本（HBV攜帶組），均處于免疫耐受期，符合慢性HBV攜帶者的診斷標準［10］：HBV DNA定量水平>2×107IU/mL，血清乙型肝炎表面抗原（HBsAg）>2×104IU/mL，乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）陽性，但血清丙氨酸轉氨酶（ALT）和天冬氨酸轉氨酶（AST）持續正常（1年內連續隨訪3次，每次至少間隔3個月），肝臟組織病理檢查無明顯炎癥壞死或纖維化。其中男24例、女11例，年齡（37.19 ± 5.12）歲，BMI（23.87 ± 2.68）kg/m2。選取35例手術切除的肝血管瘤旁正常肝組織（正常組），其中男22例、女13例，年齡（37.03 ± 4.87）歲，BMI（23.91 ± 2.17）kg/m2。三組性別、年齡和BMI比較差異無統計學意義。CHB組和HBV攜帶組均用彈射式組織活檢槍取肝組織（長度約1.5 cm）；正常組為術中留取的肝血管瘤旁正常肝組織，標本均凍存于-70 ℃冰箱。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2臨床相關血液指標檢測采集受試者晨起空腹肘靜脈血1.5 mL，2 500 r/min離心10 min（離心半徑13.5 cm），分離血清。用美國貝克曼庫爾特公司AU680全自動生化檢測儀檢測ALT、AST、總膽紅素（TB），試劑均購于恒遠生物科技有限公司。熒光聚合酶鏈式反應（FQ-PCR）檢測血清HBV-DNA載量，取血清100 μL，加入100 μL的DNA提取液，混合后12 000 r/min離心10 min（離心半徑13.5 cm），棄去上清后加入25 μL樣本處理液，100 ℃水浴預熱10 min后再次離心10 min，取2 μL上清液加入PCR管。用美國ABI公司7500熒光定量PCR儀對HBV-DNA進行定量檢測。試劑盒購于上海浩源生物科技有限公司，操作步驟按照試劑盒說明進行。

1.3肝組織HNF-1α表達檢測采用Western blotting法。取肝臟組織，用RIPA裂解液提取總蛋白（每克組織加入3 mL裂解液），用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，進行10% 十二烷基磺酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，用半干轉移法將蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入HNF-1α單克隆抗體（稀釋500倍，美國ABGENT公司，批號：190815 貨號：RBI 8642），GAPDH內參抗體（稀釋1 000倍，美國proteintech公司，批號：181124A，貨號：10494-1-AP，），4 ℃孵育過夜，次日除去一抗，用TBST緩沖液洗滌3次后加入羊抗兔IgG二抗（稀釋1 000倍，北京Solarbio公司，批號：190514，貨號：SE134），封閉1 h。以GAPDH作為內參，ECL發光儀進行蛋白成像，Image J軟件分析灰度值。

1.4肝組織炎癥因子表達檢測采用ELISA法。取肝臟組織，加入預冷PBS緩沖液（1 g組織中加入5 mL緩沖液），超聲勻漿后得到組織勻漿。5 000×g離心5 min，留取上清液。用ELISA試劑盒檢測上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α表達，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。試劑盒均購于武漢博士德生物科技有限公司。

2 結果

2.1三組ALT、AST、TB、HBV-DNA水平比較CHB組、HBV攜帶組和正常組ALT、AST、TB水平比較差異有統計學意義（分別為255.478、274.494、695.762，均<0.001），CHB組ALT、AST、TB水平均高于HBV攜帶組和正常組（均<0.05），CHB組HBV-DNA水平高于HBV攜帶組（<0.05）。見表1。

表1　三組ALT、AST、TB、HBV-DNA水平比較（± s）

注：與正常組比較，a<0.05；與HBV攜帶組比較，b<0.05。

2.2三組HNF-1α和炎癥因子蛋白表達比較CHB組、HBV攜帶組和正常組的HNF-1α蛋白表達比較差異有統計學意義（=166.916，<0.001），見圖1。CHB組HNF-1α蛋白表達均低于HBV攜帶組和正常組（均<0.05）。三組IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達比較差異有統計學意義（分別為217.171、90.124、137.682，均<0.001），CHB組IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達均高于HBV攜帶組和正常組（均<0.05）。見表2。

圖1　各組HNF-1α蛋白表達情況

表2　三組HNF-1α和炎癥因子蛋白表達比較（± s）

注：與正常組比較，a<0.05；與HBV攜帶組比較，b<0.05。

2.3HNF-1α診斷CHB的效能ROC曲線分析結果顯示，HNF-1α蛋白表達<1.165時診斷CHB的價值最高，為0.942（標準誤為0.024，95%：0.895～0.989，<0.001），靈敏度和特異度分別為94.29%和84.72%。

2.4CHB患者HNF-1α表達與IL-1β、IL-6、TNF-α的關系CHB患者HNF-1α蛋白表達與IL-1β、IL-6、TNF-α均呈負相關（分別為-0.309、-0.273、-0.241，均<0.05）。

2.5HNF-1α蛋白在不同炎癥分級及纖維化分期CHB患者中的表達比較炎癥分級G1級、G2級、G3級、G4級CHB患者的HNF-1α蛋白表達分別為1.01 ± 0.32、0.85 ± 0.11、0.80 ± 0.20、0.78 ± 0.10，組間比較差異有統計學意義（=4.632，<0.05），分級越高，蛋白表達越低。纖維化分期S1期、S2期、S3期、S4期CHB患者的HNF-1α蛋白表達分別為1.08 ± 0.51、0.88 ± 0.19、0.82 ± 0.17、0.70 ± 0.23，組間比較差異有統計學意義（=3.199，<0.05），分期越高，蛋白表達越低。

3 討論

CHB嚴重影響患者的生命健康和生活質量［11］。HNF是一類在肝臟內優勢表達的轉錄因子，包含HNF-1、HNF-3、HNF-4、HNF-6和CCAAT/增強子結合蛋白五個成員［12］。HNF-1包含HNF-1α、HNF-1β兩個成員，HNF-1α在維持細胞分化表型及代謝中發揮重要作用，其基因定位于染色體12q24.2上，全長3 241 bp［13］。研究發現，HNF-1α具有調節肝酶，調節糖脂代謝，調節膽汁酸代謝等作用，在肝臟腫瘤發生、發展中起重要作用［14］。HNF-1α在CHB中的作用既往少有報道。本研究發現，CHB組HNF-1α蛋白表達均低于HBV攜帶組和正常組，提示HNF-1α可能與CHB的發生有關。ROC曲線分析結果顯示，HNF-1α診斷CHB的為0.942，靈敏度和特異度分別為94.29%和84.72%，進一步證實HNF-1α在CHB早期診斷中的價值。

HBV感染后肝臟會發生炎癥損傷［15］，有研究發現，HBV感染患者血清TNF-α、IL-10、IL-6、IL-4、IL-2表達明顯升高［16］。本研究中CHB組IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達均高于HBV攜帶組和正常組，且攜帶組高于正常組。近年來，HNF-1α在肝臟免疫炎癥損傷中的作用受到重視。抑制肝細胞HNF-1α表達可激活一系列炎癥信號通路，造成肝細胞損傷［17］。下調HNF-1還能抑制NF-κB炎癥信號通路［8］。HNF-1/法尼酯X受體1信號通路激活IL-6和TNF-α，介導膿毒癥所致肝細胞免疫炎癥損傷和肝功能損傷［18］。本研究發現，CHB患者HNF-1α蛋白表達分別與IL-1β、IL-6、TNF-α呈負相關，提示HNF-1α與HBV感染所致肝臟炎癥損傷有關，HNF-1α通過炎癥損傷參與CHB的發生。

免疫炎癥損傷與CHB發展密切相關［1］。Th1/Th2相關炎癥細胞因子（干擾素γ、IL-2、IL-4、IL-6）參與了慢性HBV感染患者肝臟纖維化進展［19］。本研究發現，CHB炎癥分級越高HNF-1α蛋白表達越低；纖維化分期越高，HNF-1α蛋白表達越低，提示HNF-1α參與CHB病情進展。葛善飛等［20］發現，HNF-1α與大鼠肝纖維化有關，表達越低，纖維化越重。與本研究結果類似。

綜上所述，CHB患者肝組織HNF-1α表達與炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α呈負相關，HNF-1α可能參與CHB的發生、發展。但本研究樣本量相對較小；未檢測CHB患者血清HNF-1α表達；未分析HNF-1α靶基因的表達變化。

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《山東醫藥》對來稿中統計學處理的有關要求

統計學分析方法的選擇：對于定量資料，應根據所采用的設計類型、資料所具備的條件和分析目的，選用合適的統計學分析方法，不應盲目套用檢驗和單因素方差分析；對于定性資料，應根據所采用的設計類型、定性變量的性質和頻數所具備的條件以及分析目的，選用合適的統計學分析方法，不應盲目套用2檢驗。對于回歸分析，應結合專業知識和散布圖，選用合適的回歸類型，不應盲目套用簡單直線回歸分析，對具有重復實驗數據的回歸分析資料，不應簡單化處理；對于多因素、多指標資料，要在一元分析的基礎上，盡可能運用多元統計學分析方法，以便對因素之間的交互作用和多指標之間的內在聯系進行全面、合理的解釋和評價。統計結果的解釋和表達：當P <0.05(或P <0.01)時，應說明對比組之間的差異有統計學意義，而不應說對比組之間具有顯著性(或非常顯著性)的差別；應寫明所用統計學分析方法的具體名稱(如：成組設計資料的檢驗、兩因素析因設計資料的方差分析、多個均數之間兩兩比較的檢驗等)，統計量的具體值(如值、2值、值等)，應盡可能給出具體的值；當涉及總體參數(如總體均數、總體率等)時，在給出顯著性檢驗結果的同時，再給出95％可信區間。

侯丹（E-mail： pla202h@163.com）

10.3969/j.issn.1002-266X.2022.28.013

R512.62

A

1002-266X（2022）28-0055-04

（2022-05-28）