三七皂苷R1上調miR-132對人下咽鱗癌FaDu細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用

高鑫，樊新龍，曾巍，梁冀望，郭囡，楊驍，趙月皎

三七皂苷R1上調miR-132對人下咽鱗癌FaDu細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用

高鑫，樊新龍，曾巍，梁冀望，郭囡，楊驍，趙月皎

遼寧省腫瘤醫院頭頸外科，沈陽 110042

探討三七皂苷R1（NGR1）對人下咽鱗癌FaDu細胞中miR-132表達的影響及其抗腫瘤作用機制。以0、75、150、300 μmol/L NGR1處理FaDu細胞，并分別標記為Control組、75 μmol/L NGR1組、150 μmol/L NGR1組、300 μmol/L NGR1組。采用MTT法檢測各組細胞增殖能力，Real-time PCR檢測各組細胞miR-132相對表達量。再將FaDu細胞分為Control組（未處理）、NGR1組（給予150 μmol/L NGR1）、miR-132 inhibitor-NC組（轉染miR-132 inhibitor-NC）、miR-132 inhibitor組（轉染miR-132 inhibitor）、miR-132 inhibitor-NC+NGR1組（轉染inhibitor-NC后，給予150 μmol/L NGR1處理）、miR-132 inhibitor+NGR1組（轉染inhibitor后，給予150 μmol/L NGR1處理），通過MTT、劃痕以及Transwell侵襲試驗檢測抑制或上調miR-132后對FaDu細胞增殖、遷移以及侵襲能力的影響。Control組、75 μmol/L NGR1組、150 μmol/L NGR1組、300 μmol/L NGR1組FaDu細胞增殖能力依次降低，細胞中miR-132的相對表達量依次升高，組間差異有統計學意義（均<0.05）。與Control組相比，miR-132 inhibitor組FaDu細胞活力、遷移侵襲能力增強，NGR1組FaDu細胞活力、遷移、侵襲能力減弱（均<0.05）。miR-132 inhibitor+NGR1組與NGR1組比較，FaDu細胞活力、遷移、侵襲能力增強（均<0.05）。NGR1可能通過上調miR-132表達，抑制FaDu細胞的增殖、遷移以及侵襲。

三七皂苷R1；FaDu細胞；miR-132；細胞增殖活力；遷移能力；侵襲能力

頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其中的下咽鱗狀細胞癌（HSCC）是HNSCC中病死率最高的一種，患者5年總體生存率僅為35 %［1］。三七皂苷R1（NGR1）是從五加科植物三七的根莖中提取的有效成分，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等特性［2］，對結直腸癌、肝癌等多種腫瘤的發生發展均具有較好的抑制作用。研究報道，NGR1通過抑制基質金屬蛋白酶9的表達，從而抑制HCT-116細胞的遷移以及侵襲［3］。進一步研究證實，miR-132在多種癌癥中低表達，且NGR1可以上調miR-132的表達，進而減輕LPS誘導的炎癥損傷［4-5］。但NGR1的抗腫瘤作用是否通過調控miR-132表達來執行尚不清楚。2020年6月—9月，本研究對NGR1靶向miR-132抑制人下咽鱗癌FaDu細胞增殖、遷移、侵襲的作用及可能機制進行了探討。

1 材料方法

1.1材料人下咽鱗癌FaDu細胞（本院實驗室保存），DMEM培養基（Gibco，美國），三七皂苷R1（源葉生物，上海），MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（Wanleibio，沈陽），Lipofectamine 2000（Invitrogen，美國），TRIpure、Super M-MLV反轉錄酶、RNase inhibitor、2×Power Taq PCR MasterMix、SYBR Green（BioTeke，北京），Transwell小室（Corning，美國），Matrigel膠（BD，美國），結晶紫（Amresco，美國）。

1.2方法

1.2.1FaDu細胞培養將FaDu細胞置于含10 %胎牛血清的DMEM培養基中，在37 ℃、5% CO2的培養箱內培養。

1.2.2不同濃度NGR1處理后細胞增殖能力檢測將培養的FaDu細胞接種于96孔板中，每孔細胞量為5×103個。待細胞貼壁后，加入終濃度分別為0、75、150、300 μmol/L NGR1處理FaDu細胞，并分別標記為Control組、75 μmol/L NGR1組、150 μmol/L NGR1組、300 μmol/L NGR1組，每組設5個平行孔。于培養箱內孵育24 h后，每孔加入20 μL MTT染色液，在細胞培養箱內繼續孵育。4 h后吸去上清，加入150 μL Formanzan溶解液，至Formanzan完全溶解后在酶標儀上測定其在570 nm波長處OD值，觀察FaDu細胞不同濃度NGR1處理后的增殖情況。

1.2.3不同濃度NGR1處理后細胞miR-132相對表達量檢測經0、75、150、300 μmol/L NGR1處理24 h后，收集FaDu細胞，用TRIzol法提取細胞總RNA，使用紫外分光光度計測定各樣本中RNA純度以及濃度。將上述的總RNA樣本按試劑盒說明書進行反轉錄，得到對應cDNA樣本。以1 μL cDNA、0.5 μL濃度為10 μmol/L的正反向引物、10 μL SYBR GREEN mastermix和8 μL ddH2O配成反應體系進行PCR擴增：94 ℃預變性5 min，1個循環；95 ℃變性15 s、58 ℃ 退火30 s、72 ℃ 延伸30 s，40個循環，以U6為內參，檢測不同濃度NGR1處理下FaDu細胞中miR-132的相對表達量，檢測結果經2-ΔΔCt處理。miR-132正向引物：TAACAGTCTACAGCCATGGTCG；反向引物：5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3'。 U6正向引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACT-3'；反向引物：5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3'。

1.2.4抑制或上調miR-132后細胞活力檢測取對數生長期的FaDu細胞，將細胞接種至6孔板，于培養箱中過夜。待細胞密度達70 %以上時，開始進行轉染。將細胞分為Control組（未處理）、NGR1組（給予150 μmol/L NGR1）、miR-132 inhibitor-NC組（轉染miR-132 inhibitor-NC）、miR-132 inhibitor組（轉染miR-132 inhibitor）、miR-132 inhibitor-NC+NGR1組（轉染inhibitor-NC后，給予150 μmol/L NGR1處理）、miR-132 inhibitor+NGR1組（轉染inhibitor后，給予150 μmol/L NGR1處理）。根據Lipofectamine 2000說明書將miR-132 inhibitor-NC以及miR-132 inhibitor轉染至FaDu細胞中。待轉染細胞24 h后，加入150 μmol/L NGR1處理，并設置相應對照組。MTT法檢測各組細胞活力。

1.2.5抑制或上調miR-132后細胞遷移能力檢測以適當密度將FaDu細胞接種至6孔板后，參照1.2.4中方法處理細胞，各組處理后將細胞培養基更換為無血清培養基并加入1 μg/mL的絲裂霉素C處理1 h。利用200 μL pipette tip造成細胞劃痕，用無血清培養基清洗細胞表面1次，除去細胞碎片，顯微鏡下（100×）觀察并按組拍照，記下照片中細胞的位置。將各組細胞置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，24 h后進行拍照記錄，計算各組細胞遷移率。

1.2.6抑制或上調miR-132后細胞侵襲能力檢測所有試劑以及器材在冰上預冷，將Transwell小室置于24孔板內，用預先稀釋好的Matrigel膠包被小室，在37 ℃培養箱放置2 h使膠凝固。以適當密度將對數生長期FaDu細胞接種至6孔板后，參照1.2.4中方法處理細胞，收集各組處理后的細胞，以無血清培養基將其稀釋成細胞懸液備用；向下室加入800 μL含10 % FBS的培養液，上室加入1×104個/孔的細胞懸液，體積為200 μL，每組設置5個復孔。將24孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下的細胞培養箱中培養24 h。4 %多聚甲醛固定25 min，0.4 %結晶紫染色5 min，蒸餾水沖洗。倒置顯微鏡（200×）下拍照，并對侵襲至微孔膜下層的細胞計數，每個樣本選取5個視野計數細胞個數。

2 結果

2.1NGR1對FaDu細胞增殖的影響處理24 h后，Control組、75 μmol/L NGR1組、150 μmol/L NGR1組、300 μmol/L NGR1組FaDu細胞增殖能力OD值分別為0.513 ± 0.057、0.436 ± 0.060、0.386 ± 0.043、0.270 ± 0.027，細胞增殖能力依次降低，組間差異有統計學意義（均<0.05）。150 μmol/L NGR1組、300 μmol/L NGR1組均低于Control組（均<0.05）。

2.2NGR1對FaDu細胞中miR-132表達的影響處理24 h后，Control組、75 μmol/L NGR1組、150 μmol/L NGR1組、300 μmol/L NGR1組FaDu細胞中miR-132、相對表達量分別為1.00 ± 0.10、1.63 ± 0.14、2.11 ± 0.09、3.07 ± 0.10，各組FaDu細胞中miR-132的相對表達量統計學差異有統計學意義（<0.05）；75 μmol/L NGR1組、150 μmol/L NGR1組、300 μmol/L NGR1組與Control組相比，miR-132的表達水平升高（<0.05）。本研究后續實驗采用150 μmol/L NGR1處理細胞。

2.3抑制或上調miR-132對FaDu細胞增殖的影響處理FaDu細胞24 h后， Control組、NGR1組、miR-132 inhibitor-NC組、miR-132 inhibitor組、miR-132 inhibitor-NC+NGR1組、miR-132 inhibitor+NGR1組細胞增殖活力OD值分別為0.766 ± 0.073、0.470 ± 0.056、0.760 ± 0.110、1.008 ± 0.097、0.463 ± 0.075、0.723 ± 0.079；與Control組相比，miR-132 inhibitor組FaDu細胞活力增強，NGR1組FaDu細胞活力減弱，差異均有統計學意義（均<0.05）。miR-132 inhibitor+NGR1組與NGR1組比較，FaDu細胞活力增強（<0.05）。NGR1和miR-132 inhibitor共同處理細胞時，miR-132 inhibitor能夠明顯逆轉NGR1對FaDu細胞增殖的抑制。

2.4抑制或上調miR-132對FaDu細胞遷移和侵襲的影響與Control組相比，miR-132 inhibitor組FaDu細胞遷移、侵襲能力增強，NGR1組FaDu細胞遷移、侵襲能力減弱，差異均有統計學意義（均<0.05）。miR-132 inhibitor+NGR1組與NGR1組比較，FaDu細胞遷移、侵襲能力增強（均<0.05）。轉染miR-132 inhibitor后，NGR1對FaDu細胞遷移和侵襲的抑制作用受到逆轉。見表1。

表1　抑制或上調miR-132對FaDu細胞遷移和侵襲的影響（± s）

注：與Control組相比，*<0.05；與NGR1組相比，**<0.05。

3 討論

HSCC在頭頸部惡性腫瘤中約占5%，是一種高侵襲性惡性腫瘤。盡管目前在HSCC的治療方面取得了一些進展，但由于局部復發，遠端浸潤以及耐藥性的產生等，HSCC患者預后仍不理想。因此，如何安全有效地防治腫瘤細胞的轉移對改善HSCC患者預后尤為重要［6］。由于中藥具有不良反應少、效率高和價格低等優勢，其抗腫瘤作用逐漸成為目前的研究熱點。已有研究證實，NGR1對心肌、中樞神經系統缺血損傷具有保護作用，并且在結直腸癌、肝癌中顯示具有抗腫瘤細胞轉移的作用［7］。但NGR1對HSCC細胞的增殖、侵襲是否同樣具有抑制作用，目前還尚未有研究報道。本研究結果顯示，NGR1能顯著抑制FaDu細胞的增殖、遷移以及侵襲能力，但NGR1發揮抗腫瘤效應的具體調控機制還有待進一步明確。

大量研究顯示，miRNA與HSCC的發生發展密切相關，在腫瘤細胞的增殖、遷移以及侵襲等生物學過程中發揮著重要的調控作用。KIKKAWA等［8］研究發現，抑癌基因miR-489靶向PTPN11可抑制HSCC的增殖；ZHOU等［9］研究顯示，miR-204與HSCC患者的不良預后有關，且過表達miR-204能夠抑制腫瘤細胞的遷移以及侵襲。越來越多的研究發現，miR-132在多種腫瘤中發揮著抑癌作用。miR-132通過阻斷USP9X誘導的上皮間質轉化而抑制肺癌細胞的遷移以及侵襲［10］； miR-132通過靶向E2F5抑制卵巢癌細胞的增殖以及侵襲［11］；miR-132在頭頸部惡性腫瘤中存在差異表達［12］。SUN等［5］研究表明，NGR1能上調PC12細胞中miR-132的表達。我們研究顯示，NGR1對FaDu細胞增殖能力有抑制作用；隨著NGR1濃度升高，FaDu細胞增殖能力依次降低。通過檢測NGR1處理后FaDu細胞中miR-132表達發現，NGR1能上調miR-132在FaDu細胞中的表達；以上結果提示NGR1可能通過上調miR-132參與HSCC癌細胞轉移的調控過程。為了進一步驗證miR-132是否在NGR1抑制FaDu細胞的增殖、遷移以及侵襲等過程中發揮關鍵作用，我們用miR-132 inhibitor轉染FaDu細胞，并檢測NGR1處理后細胞的增殖、遷移以及侵襲能力是否發生變化。結果顯示，抑制miR-132能夠逆轉NGR1對FaDu細胞增殖、遷移以及侵襲能力的抑制。因此，我們認為NGR1對HSCC發揮抗腫瘤效應的機制與其上調FaDu細胞miR-132表達有關。

綜上所述，NGR1對人下咽鱗癌FaDu細胞的增殖、遷移以及侵襲有抑制作用；人下咽鱗癌FaDu細胞miR-132的表達下調；NGR1通過上調FaDu細胞miR-132的表達，發揮抑制FaDu細胞侵襲和轉移的作用。本研究為闡明NGR1抑制腫瘤細胞侵襲轉移的分子機制提供了新的證據，也為HSCC的臨床治療提供了新的方法及思路。

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NGR1 inhibits proliferation， migration， and invasion of FaDu cells through up-regulating miR-132 expression

，，，，，，

，，110042，

To investigate the effect of notoginseng saponin R1 （NGR1） on the expression of miR-132 in human hypopharyngeal squamous cell carcinoma cell line FaDu， and to explore its possible anti-tumor mechanism.FaDu cells were treated with 0， 75， 150 and 300 μmol/L NGR1， and were labeled as the Control group， 75 μmol/L NGR1 group， 150 μmol/L NGR1 group and 300 μmol/L NGR1 group， respectively. The proliferation ability of cells in each group was detected by MTT assay， and the relative expression of miR-132 in each group was detected by real-time PCR. FaDu cells were further divided into the Control group （no treatment）， NGR1 group （given 150 μmol/L NGR1）， miR-132 inhibitor-NC group （transfected with miR-132 inhibitor-NC）， miR-132 inhibitor group （transfected with miR-132 inhibitor）， miR-132 inhibitor-NC+NGR1 group （150 μmol/L NGR1 treatment after transfection with inhibitor-NC）， and miR-132 inhibitor+NGR1 group （150 μmol/L NGR1 treatment after transfection with inhibitor）， respectively. MTT， Scratch and Transwell invasion assays were used to detect the effects of inhibition or up-regulation of miR-132 on the proliferation， migration and invasion abilities of FaDu cells.The proliferation abilities of FaDu cells in the Control group， 75 μmol/L NGR1 group， 150 μmol/L NGR1 group and 300 μmol/L NGR1 group decreased successively， and the relative expression of miR-132 in FaDu cells increased successively， and the differences were statistically significant （all<0.05）. Compared with Control group， the viability， migration and invasion abilities of FaDu cells in the miR-132 inhibitor group were enhanced， and the viability， migration and invasion abilities of FaDu cells in the NGR1 group were weakened （all<0.05）. Compared with the NGR1 group， the viability， migration and invasion of FaDu cells in miR-132 inhibitor+NGR1 group significantly increased （all<0.05）.NGR1 may inhibit the proliferation， migration and invasion of FaDu cells by up-regulating the expression of miR-132.

notoginseng saponin R1； FaDu cells； miR-132； cell proliferation activity； migration ability； invasive ability

10.3969/j.issn.1002-266X.2022.28.011

R285

A

1002-266X（2022）28-0047-04

（2022-07-20）

遼寧省自然科學基金資助項目（2019-ZD-0595）。

趙月皎（E-mail：13352468831@163.com）