lncRNA LINC00174對骨肉瘤細胞惡性生物學行為的影響及其機制

劉行，李磊

lncRNA LINC00174對骨肉瘤細胞惡性生物學行為的影響及其機制

劉行，李磊

恩施土家族苗族自治州中心醫院關節外科診療中心，湖北恩施 445000

探討長鏈非編碼RNA（lncRNA） LINC00174對骨肉瘤細胞惡性生物學行為的影響及其機制。體外培養骨肉瘤SaOS-2細胞，隨機分為Control組、si-NC組、si-LINC00174組，si-NC組、si-LINC00174組分別轉染si-NC、si-LINC00174，Control組不予轉染，轉染6 h更換完全培養基，繼續培養24 h。收集各組細胞，采用RT-qPCR法檢測lncRNA LINC00174相對表達量，采用CCK-8法檢測細胞增殖能力，采用Transwell小室實驗檢測細胞侵襲和遷移能力，采用Western blotting法檢測上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）表達。利用生物信息學軟件starBase預測lncRNA LINC00174與miR-206的靶向結合位點，并通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證。si-LINC00174組lncRNA LINC00174相對表達量顯著低于Control組、si-NC組（均<0.05），而Control組與si-NC組比較>0.05。si-LINC00174組細胞存活率、細胞侵襲和遷移能力以及Vimentin、MMP-9、MMP-2相對表達量顯著低于Control組、si-NC組，E-cadherin相對表達量顯著高于Control組、si-NC組（均<0.05），而Control組與si-NC組比較均>0.05。經生物信息學軟件預測和雙熒光素酶報告基因實驗驗證，lncRNA LINC00174能夠靶向調控miR-206。下調lncRNA LINC00174表達能夠抑制骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，其機制可能與靶向調控miR-206有關。

骨肉瘤；長鏈非編碼RNA LINC00174；微小RNA-206；細胞增殖；細胞侵襲；細胞遷移

骨肉瘤是一種起源于間充質細胞的原發性惡性腫瘤，好發于青少年。骨肉瘤的侵襲性較高，大多數患者在確診時已經發生遠處轉移，預后較差［1］。目前，骨肉瘤的發生機制尚不明確。因此，探索骨肉瘤發生的分子機制，尋找其早期診斷和靶向治療的生物標志物具有重要意義［2］。長鏈非編碼RNA（lncRNA）能夠調控細胞生長、增殖和代謝等生物學過程，在人體多種疾病的發生中發揮重要作用，是近年來研究的熱點［3-4］。LINC00174為lncRNA家族成員之一。有研究發現，在膠質瘤、肝癌細胞中lncRNA LINC00174高表達，下調lncRNA LINC00174表達可抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移能力［5-6］。但lncRNA LINC00174在骨肉瘤中的作用尚不清楚。前期預實驗發現，lncRNA LINC00174與miR-206存在互補結合位點。miR-206是一個與腫瘤有關的小分子RNA，在骨肉瘤細胞中miR-206表達下調，而上調miR-206表達則可抑制骨肉瘤細胞的惡性表型［7］。由此推測，在骨肉瘤中lncRNA LINC00174可能通過靶向調控miR-206發揮作用。2020年10月—2022年3月，本研究探討了lncRNA LINC00174對骨肉瘤細胞惡性生物學行為的影響及其機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1材料人骨肉瘤SaOS-2細胞，購自上海奧陸生物科技有限公司。si-LINC00174、si-NC干擾序列，購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。所有引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體，購自美國Proteintech公司；波形蛋白（Vimentin）抗體，購自美國Sigma-Aldrich公司；基質金屬蛋白酶9（MMP-9）抗體，購自北京義翹神州科技股份有限公司；基質金屬蛋白酶2（MMP-2）抗體，購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；GAPDH抗體，購自美國Abcam公司。CCK-8試劑盒，購自日本同仁化學研究所；Transwell小室，購自美國Corning公司；miR-206 mimics、mimics control，購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.2細胞轉染將SaOS-2細胞接種于含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。每2或3天更換1次培養基。待細胞生長融合達到80%時，按1∶4傳代。取傳4代、對數生長期、生長狀態良好的SaOS-2細胞，以5×105個/孔接種于6孔板。隨機將細胞分為Control組、si-NC組、si-LINC00174組，每組設6個復孔。然后將6孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養24 h，按Lipofectamine 2000說明，si-NC組、si-LINC00174組分別轉染si-NC、si-LINC00174干擾序列，Control組不予轉染僅加入轉染試劑。轉染6 h更換為完全培養基，繼續培養24 h，收集細胞。采用TRIzol法抽提各組細胞總RNA，經紫外可見分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格。按逆轉錄試劑盒說明，將總RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄條件：50 ℃ 45 min，85 ℃ 5 min。以cDNA為模板，按PCR試劑盒說明進行擴增。引物序列：LINC00174上游引物5′-GGCCCAACACTTCCCTCAAA-3′，下游引物5′-CAGGGAGAAACGACCTGGAG-3′；GAPDH上游引物5′-GGTGGTCTCCCTCGACTTCAACAG-3′，下游引物5′-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′。PCR反應體系共20 μL：2×SYBR Green Master Mix 10 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O補足至20 μL；反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s共40個循環。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCT法計算LINC00174相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3細胞增殖能力檢測采用CCK-8法。將各組轉染后SaOS-2細胞接種至96孔板，每孔3×103個細胞，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。分別于培養24、48、72 h，加入CCK-8試劑10 μL，37 ℃避光孵育2 h。酶標儀于450 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值，按公式計算各組細胞存活率。細胞存活率=（實驗孔OD450值-空白孔OD450值）/（對照孔OD450值-空白孔OD450值）×100%。

1.4細胞侵襲和遷移能力檢測采用Transwell小室實驗。細胞侵襲能力檢測時，將Matrigel基質膠于4 ℃下融化，取Matrigel基質膠50 μg與不含血清的細胞培養液95 μL混合，包被Transwell小室底部膜的上室面，37 ℃孵育1 h。將各組轉染后SaOS-2細胞用不含血清的細胞培養液重懸，制成密度1×105個/mL的細胞懸液。取細胞懸液200 μL加入Transwell小室上室，下室加入含血清的細胞培養液600 μL。然后將Transwell小室置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。常規培養24 h后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕拭去上室面未穿膜細胞，95%甲醇固定20 min，0.25%結晶紫染色15 min，顯微鏡下隨機選取5個200倍不重疊視野，計數穿膜細胞數。以穿膜細胞數代表細胞侵襲能力。細胞遷移能力檢測時，Transwell小室底部膜的上室面不用Matrigel基質膠包被，其余步驟同細胞侵襲能力檢測，以穿膜細胞數代表細胞遷移能力。

1.5E-cadherin、Vimentin、MMP-9、MMP-2表達檢測采用Western blotting法。將各組轉染后SaOS-2細胞加入RIPA裂解液提取細胞核蛋白，經BCA法蛋白定量合格后，加入等體積2×Loading Buffer混勻，100 ℃變性5 min。取變性蛋白30 μg，SDS-PAGE分離（10%分離膠、5%濃縮膠）。電泳結束，將蛋白電泳產物轉印至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入E-cadherin、Vimentin、MMP-9、MMP-2、GAPDH一抗，4 ℃孵育過夜。次日，加入HRP標記后的山羊抗鼠IgG二抗，室溫孵育2 h。ECL顯色，暗室內曝光、顯影、定影。采用Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值，以GAPDH為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.6lncRNA LINC00174靶向調控miR-206預測與驗證借助在線生物信息學軟件starBase（https：//starbase.sysu.edu.cn/）預測lncRNA LINC00174與miR-206的靶向結合位點。根據突變位點設計lncRNA LINC00174野生型（WT）和突變型（MUT）質粒，按Lipofectamine 2000說明，將其分別同miR-206 mimics、mimics control共轉染至SaOS-2細胞，將轉染后SaOS-2細胞分為mimics control+lncRNA LINC00174 WT組、mimics control+lncRNA LINC00174 MUT組、miR-206 mimics+lncRNA LINC00174 WT組和miR-206 mimics+LINC00174 MUT組。常規培養24 h，按雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明檢測各組熒光素酶活性。

2 結果

2.1三組lncRNA LINC00174表達比較Control組、si-NC組、si-LINC00174組lncRNA LINC00174相對表達量分別為1.00 ± 0.10、0.99 ± 0.12、0.45 ± 0.05。si-LINC00174組lncRNA LINC00174相對表達量顯著低于Control組、si-NC組（均<0.05），而Control組與si-NC組比較>0.05。

2.2三組細胞增殖、侵襲和遷移能力比較見表1。

表1　三組細胞增殖、侵襲和遷移能力比較（± s）

注：與Control組比較，*<0.01；與si-NC組比較，#<0.01。

2.3三組E-cadherin、Vimentin、MMP-9、MMP-2表達比較見表2。

表2　三組E-cadherin、Vimentin、MMP-9、MMP-2相對表達量比較（± s）

注：與Control組比較，*<0.01；與si-NC組比較，#<0.01。

2.4lncRNA LINC00174和miR-206的靶向調控關系生物信息學軟件預測顯示，lncRNA LINC00174與miR-206存在靶向結合位點。mimics control+lncRNA LINC00174 WT組、mimics control+lncRNA LINC00174 MUT組、miR-206 mimics+lncRNA LINC00174 WT組和miR-206 mimics+lncRNA LINC00174 MUT組熒光素酶活性分別為1.00 ± 0.11、1.00 ± 0.08、0.35 ± 0.04、0.99 ± 0.11。miR-206 mimics+lncRNA LINC00174 WT組熒光素酶活性顯著低于mimics control+lncRNA LINC00174 WT組、mimics control+lncRNA LINC00174 MUT組、miR-206 mimics+lncRNA LINC00174 MUT組（均<0.05）。

3 討論

骨肉瘤是一種起源于間充質細胞的原發性惡性腫瘤，其病因和發病機制尚不明確，可能與遺傳因素、病毒感染、輻射以及不良生活習慣等因素有關。骨肉瘤的侵襲性較高，早期即可發生遠處轉移，預后較差，也是導致治療失敗的重要原因。

lncRNA是一類無蛋白質編碼作用的多功能調控因子，是近年來生物醫療領域研究的熱點。在特定生理或病理條件下，lncRNA通過調控多種信號通路參與個體生長發育、疾病發生發展等生物學過程［8］。已有研究證實，腫瘤組織中存在多種lncRNA異常表達，并且其異常表達能夠參與腫瘤細胞的惡性生物學行為。LINC00174為lncRNA家族成員之一。既往有研究報道，lncRNA LINC00174在肝癌組織中表達上調，而下調lncRNA LINC00174表達則抑制肝癌細胞侵襲和遷移［6］。在膠質瘤細胞中lncRNA LINC00174高表達，其高表達可促進腫瘤細胞增殖［5］。lncRNA在人體生理和病理活動中的作用極為廣泛，并且在不同的生理和病理活動中作用不同。有研究報道，lncRNA可通過堿基互補的方式與miRNA結合而發揮作用，并且一種lncRNA可同時調控多個miRNA［9］。ZHAO等［10］研究發現，lncRNA LINC00174是肝細胞的致癌lncRNA，其表達上調能夠加速肝癌細胞增殖、侵襲和遷移，并抑制其凋亡，從而發揮促癌作用。SHI等［11］研究指出，lncRNA LINC00174能夠通過海綿化miR-1523-3p并增加SLC2A1表達，加速膠質瘤惡性轉變，可作為膠質瘤診斷和治療的分子靶點。但目前lncRNA LINC00174在骨肉瘤發生、發展中的作用尚不清楚。本研究結果顯示，si-LINC00174組lncRNA LINC00174相對表達量顯著低于Control組、si-NC組，而Control組與si-NC組比較差異無統計學意義；si-LINC00174組細胞存活率、細胞侵襲和遷移能力顯著低于Control組、si-NC組，而Control組與si-NC組比較差異均無統計學意義。提示在骨肉瘤細胞中lncRNA LINC00174表達上調，而下調lncRNA LINC00174表達則可抑制骨肉瘤細胞增殖、侵襲和遷移。

腫瘤細胞的侵襲和遷移過程極為復雜，在發生侵襲和遷移之前會合成大量細胞外基質降解酶，這些細胞外基質降解酶能夠降解細胞外基質，為腫瘤細胞的侵襲和遷移提供條件［12］。基質金屬蛋白酶是主要的細胞外基質降解酶。MMP-2和MMP-9均屬于基質金屬蛋白酶家族成員，是調節細胞外基質降解的重要蛋白水解酶，可通過影響上皮間質轉化促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移［13-14］。上皮間質轉化是指間質細胞特性逐漸增加，而上皮細胞特性逐漸消失的過程。E-cadherin是上皮間質轉化的重要標志蛋白之一，E-cadherin表達下調可導致細胞間黏附性降低，細胞由上皮樣轉化為間質樣［15］。Vimentin是間質細胞標志蛋白，在腫瘤細胞上皮間質轉化過程中表達上調，可參與腫瘤細胞的侵襲和遷移過程［16］。既往研究報道，上皮間質轉化是腫瘤細胞發生侵襲和遷移的早期標志［17］。本研究結果顯示，si-LINC00174組Vimentin、MMP-9、MMP-2相對表達量顯著低于Control組、si-NC組，E-cadherin相對表達量顯著高于Control組、si-NC組，而Control組與si-NC組比較差異均無統計學意義。提示下調lncRNA LINC00174表達能夠通過抑制骨肉瘤細胞上皮間質轉化而抑制腫瘤細胞惡性生物學行為。miR-206定位于人6號染色體，屬于miR-1家族成員。有研究報道，在肺癌、肝癌等惡性腫瘤細胞中miR-206表達下調，上調miR-206表達則可抑制腫瘤細胞增殖［18］。WANG等［7］研究報道，上調miR-206表達可抑制circTCF25誘導的骨肉瘤細胞增殖和遷移。本研究生物信息學軟件預測顯示，lncRNA LINC00174與miR-206存在靶向結合位點；雙熒光素酶報告基因實驗發現，miR-206 mimics+lncRNA LINC00174 WT組熒光素酶活性顯著低于mimics control+lncRNA LINC00174 WT組、mimics control+lncRNA LINC00174 MUT組、miR-206 mimics+lncRNA LINC00174 MUT組。結果提示，lncRNA LINC00174與miR-206存在靶向調控關系，lncRNA LINC00174可能通過靶向調控miR-206抑制骨肉瘤細胞的惡性生物學行為。

綜上所述，下調lncRNA LINC00174表達能夠抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，其機制可能與靶向調控miR-206有關。但lncRNA LINC00174靶向調控miR-206的具體機制尚不明確，仍需進一步研究。

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Effect and mechanism of lncRNA LINC00174 on malignant biological behavior of osteosarcoma

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，，445000，

To investigate the effect of long non-coding RNA （lncRNA） LINC00174 on the malignant biological behavior of osteosarcoma and its mechanism.Osteosarcoma SaOS-2 cells were cultured in vitro， and were randomly divided into the Control group， si-NC group， and si-LINC00174 group. The SaOS-2 cells in the si-NC group and si-LINC00174 group were transfected with si-NC and si-LINC00174， respectively， and the Control group was not transfected. The complete medium was replaced at 6 h after transfection， and the culture was continued for 24 h. The cells of each group were collected， and the relative expression of lncRNA LINC00174 was detected by RT-qPCR， the cell proliferation ability was detected by CCK-8， the cell migration and invasion abilities were detected by Transwell chamber assay， and the epithelial cadherin （E-cadherin）， Vimentin， matrix metalloproteinase 9 （MMP-9）， matrix metalloproteinase 2 （MMP-2） expression levels were detected by Western blotting. The bioinformatics software starBase predicted the targeted binding sites of lncRNA LINC00174 and miR-206， and they were verified by dual-luciferase reporter gene experiment.The relative expression level of lncRNA LINC00174 was significantly lower in the si-LINC00174 group than in the Control group and the si-NC group （both<0.05）， and no significant difference was found between the Control group and the si-NC group （>0.05）. The si-LINC00174 group had significantly lower cell viability， cell invasion and migration abilities， and the relative expression levels of Vimentin， MMP-9， and MMP-2 than the Control group and si-NC group， but the relative expression of E-cadherin was significantly higher than those of the Control group and the si-NC group （both<0.05）， while no significant difference was found between Control group and si-NC group （all>0.05）. Predicted by bioinformatics software and verified by dual-luciferase reporter gene experiment， lncRNA LINC00174 could target and regulate miR-206.Down-regulation of lncRNA LINC00174 expression can inhibit the proliferation， migration and invasion of osteosarcoma cells， and the mechanism may be related to the targeted regulation of miR-206.

osteosarcoma； long non-coding RNA LINC00174； microRNA-206； cell proliferation； cell invasion； cell migration

10.3969/j.issn.1002-266X.2022.28.010

R738.1

A

1002-266X（2022）28-0042-05

（2021-10-22）

李磊（E-mail： bill821107@126.com）