基于網絡藥理學探討苦參對人結腸癌細胞增殖及p53蛋白表達的影響機制

張天澤，宋娟，尹傳華，杜楠，劉春杰，王利寧，李克明，張賀

· 基礎研究 ·

基于網絡藥理學探討苦參對人結腸癌細胞增殖及p53蛋白表達的影響機制

張天澤1，宋娟2，尹傳華3，杜楠3，劉春杰3，王利寧4，李克明5，張賀6

1 北京中醫藥大學中醫學院，北京 100029；2 滕州市中醫醫院肛腸科；3 沂南縣人民醫院普外科；4 乳山市人民醫院腫瘤科；5 山東省中醫藥研究院藥理研究所；6 山東中醫藥大學附屬醫院藥學部

觀察苦參堿對于人結腸癌細胞株HT-29增殖及p53蛋白表達的影響，探討中藥苦參治療結腸癌的作用機制。選取人結腸癌細胞株 HT-29，用IL-6處理造模后加不同濃度苦參堿干預，并設置空白對照組，檢測IL-6處理模型組及不同濃度苦參堿干預各組HT-29細胞活力及p53蛋白表達情況。通過網絡檢索TCMSP、OMIM和Disgenet三個數據庫得到苦參主要活性成分及對應疾病的靶點，運用String數據庫及Cytoscape軟件將苦參對結腸癌的潛在靶點構建PPI，將藥物疾病共同基因導入Metasacpe數據平臺進行GO和KEGG富集分析。人結腸癌細胞株 HT-29模型組細胞活力較空白組增強，p53蛋白表達水平下降；經苦參堿干預后各組細胞活力明顯降低，p53蛋白表達水平增高。通過網絡檢索數據庫共檢索出苦參的45個有效成分和22個潛在作用靶點，檢索出的治療通路主要有VEGF信號通路、癌癥通路、晚期糖基化產物（AGE）-晚期糖基化終末產物受體（RAGE）信號通路等。苦參能抑制結腸癌細胞增殖，并提高抗腫瘤基因p53蛋白的表達；其機制為苦參中抗癌活性成分通過多種信號通路作用于p53、IL-6、AKT1、PTGS2等靶點，從而對結腸癌起到干預作用。

結腸腫瘤；苦參；細胞增殖，p53蛋白；網絡藥理學

目前，結腸癌的臨床主要治療方法包括化療、手術及免疫治療等，但存在嚴重不良反應以及療效不理想等問題［1］。研究發現，中藥具有成分多樣性、治療通路多樣性及治療靶點多樣性的特點，在調節結腸癌免疫功能方面有顯著療效［2］。2020版《中國藥典》記載中藥苦參其性味苦、寒，臨床有清熱燥濕、殺蟲、利尿的功效［3］。有證據表明，苦參的活性成分苦參堿對結腸癌具有干預作用，但具體的作用機制目前并不是特別清楚。網絡藥理學因其系統、整體性的特點，廣受學者重視［4］。本研究以體外細胞試驗觀察苦參堿對人結腸癌細胞株HT-29增殖及蛋白表達的影響，通過網絡數據庫分析苦參治療結腸癌的作用靶點與作用機制，為尋求結腸癌更有效的治療方式提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料人結腸癌細胞株 HT-29（購自中國科學院上海細胞庫），苦參堿（購自 Sigma 公司），一抗p53、二抗（均購自Cell Signal Technology 公司），白細胞介素6（IL-6）（美國Thermo Fisher公司），青-鏈霉素、胎牛血清、RPMI 1640 培養基（均購自美國Hyclone 公司），Western Blot 曝光儀（AZURE公司），酶標儀（瑞士 TECAN 公司）。

1.2方法

1.2.1人結腸癌細胞活力及p53蛋白表達檢測①細胞培養及活力檢測：采用MTT法。將HT-29細胞接種于RPMI-1640 細胞培養基內進行培養，細胞培養基中含10%的胎牛血清和1%的青-鏈霉素。待細胞長勢良好，生長至對數生長期，將其消化后接種于96孔培養板，設置空白組（無任何藥物）、模型組（10 ng/mL的IL-6）、4 mg/mL苦參堿聯合組（10 ng/mL的IL-6聯合4 mg/mL苦參堿）、10 mg/mL苦參堿聯合組（10 ng/mL的IL-6聯合10 mg/mL苦參堿）。調整細胞的密度為1×105/mL，選取96孔板，每孔加入100 μL，細胞培養過夜，待貼壁后按照分組給藥，每組設3個復孔，給藥干預后再繼續培養，24 h后于每孔加入20 μL濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液，繼續孵育，4 h后吸去上清液，之后每個孔中加入150 μL DMSO，放入酶標儀中在波長為570 nm處檢測各組吸光度（A），并計算各組的細胞活力。細胞活力（%）=檢測組A/空白組A×100%。②p53蛋白表達檢測：采用Western blotting 法。將提取的細胞總蛋白配置成SDS-PAGE蛋白膠，加樣電泳。電泳結束后將其轉移至PVDF膜上，條件為300 mA 轉模40 min，用5%的脫脂奶粉進行封閉，1 h后用TBST洗滌，加入一抗（p53），室溫孵4 h，TBST洗滌3遍，洗膜后放入二抗，室溫孵育，2 h后ECL顯影，使用化學發光系統進行條帶檢測和分析，保存數據。

1.2.2網絡數據庫檢索分析①藥物化學成分及其作用靶點收集：根據ADME的參數標準，設定篩選標準為口服利用度≥30%、類藥性≥0.18；通過檢索TCMSP網絡數據庫得到苦參的主要化學成分及對應的靶點，之后將檢索到的作用靶點輸入到Uniprot網絡數據庫中進行檢索，設定物種選項為“human”，檢索篩選到與靶點相對應的基因名稱。②疾病靶點獲取：通過OMIM（http：//omim.org）以及Disgenet（http：//www.disgenet.org）數據庫以“Colon cancer”為檢索詞獲取到疾病基因，刪除重復詞組后得到疾病靶點［5］。③潛在靶點作用獲取：使用Venny2.1對藥物靶點與疾病靶點進行分析，篩選出藥物和疾病共同存在的靶點，將這些靶點視作苦參治療結腸癌的潛在靶點并繪制韋恩圖。④靶點蛋白作用關系（PPI）網絡構建及分析：將獲取到的潛在作用靶點輸入進STRING（http：//www.string-db.org）網絡數據平臺中，選定種類為人類蛋白，檢索得到各種潛在靶點蛋白之間作用關系的數據信息，使用Cytoscape軟件繪制網絡圖。⑤基因本體與京都基因及基因組百科全書通路富集分析：將獲取到的潛在作用靶點輸入進Metascape網絡數據庫中，物種選定為“homo sapiens”，選取個性化分析模式，設定<0.01，最小計數值設定為3，富集因子設定<1.5，分別得到GO中的生物過程（BP）、分子功能（MF）、細胞組成（CC）和KEGG富集分析結果，并通過微信在線作圖工具平臺將數據可視化。⑥網絡模型的構建及分析：使用Cytoscape3.7軟件對苦參治療結腸癌的潛在靶點、苦參活性成分以及KEGG富集分析通路進行分析，獲取到“研究藥物-活性成分-作用靶點-信號通路-治療疾病”的關系圖，對苦參治療結腸癌的結果進行可視化分析。

2 結果

2.1苦參對人結腸癌細胞增殖的影響空白組、模型組、4 mg/mL苦參堿聯合組、10 mg/mL苦參堿聯合組HT-29細胞存活率分別為（100.8 ± 4.15）%、（178.6 ± 3.27）%、（117.4 ± 2.68）%、（83.4 ± 4.22）%；模型組與空白組、不同濃度苦參堿聯合組與模型組、4 mg/mL苦參堿聯合組與10 mg/mL苦參堿聯合組之間HT-29細胞存活率比較差異均有統計學意義（均<0.05）。顯示在10 ng/mL IL-6 的刺激下，模型組HT-29細胞細胞活力較空白組增強，經不同濃度苦參堿處理后細胞活力受到明顯抑制，且呈現劑量依賴性。

2.2苦參對人結腸癌細胞p53蛋白表達的影響空白組、模型組、4 mg/mL苦參堿聯合組、10 mg/mL苦參堿聯合組HT-29細胞p53 蛋白表達分別為0.62 ± 0.3、0.36 ± 0.47、0.59 ± 1.04、0.75 ± 0.25；模型組與空白組、不同濃度苦參堿聯合組與模型組、4 mg/mL苦參堿聯合組與10 mg/mL苦參堿聯合組之間p53 蛋白表達比較差異均有統計學意義（均<0.05）。顯示與空白組比較，IL-6刺激HT-29細胞可引起p53蛋白表達水平下降，經不同濃度的苦參堿干預后p53蛋白表達水平增高，且呈現劑量依賴性。

2.3基于網絡藥理學苦參對人結腸癌細胞增殖及p53蛋白表達的影響機制

2.3.1苦參活性成分及作用靶點信息根據篩選原則，在TMCSP數據庫中獲得苦參活性成分共45個，可預測到190個對應的非重復靶點，并在Uniprot數據庫中獲得對應基因名。將以上獲得的45個苦參靶點和190個結腸癌靶點導入Venny2.1，兩者取交集后獲得共同靶點22個，這22個共同靶點即為苦參治療結腸癌的潛在作用靶點。

2.3.2苦參治療結腸癌潛在作用靶點的PPI將獲得的22個共同靶點導入至STRING網絡數據庫中，選擇“Homo sapiens”模式，獲取不同蛋白之間關系網絡圖，將其保存為TSV格式文件，并使用Cytoscape軟件進行分析，運用“Network Analyzer”的功能進行拓撲分析，獲取到一個由22個節點，324條邊構成的網絡關系圖。其中Degree值排名前10包括p53、蛋白激酶B1（AKT1）、內皮生長因子A（VEGFA）、第10號染色體缺失性磷酸酶-張力蛋白同源物基因（PTEN）、細胞周期蛋白D1（CCND1）、胱天蛋白酶8（CASP8）、erb-b2受體酪氨酸激酶2（ERBB2）、雌激素受體（ESR1）、IL6以及環氧合酶2（PTGS2）。可預測這些靶點是苦參治療結腸癌的潛在靶點（見圖1）。

圖1　苦參治療結腸癌潛在作用靶點PPI

2.3.3GO和KEGG富集分析情況GO分析中，BP結果顯示苦參治療結腸癌的生物過程涉及細胞對非生物刺激的反應、蛋白質磷酸化的積極調節、T 細胞激活、上皮細胞增殖等，CC結果顯示主要涉及基底外側質膜、核被膜、囊泡腔等，MF結果顯示一氧化氮合成酶調節器活性、蛋白質激酶活性、生長因子受體結合等。KEGG分析結果顯示，苦參治療結腸癌主要涉及癌癥通路、晚期糖基化產物（AGE）-晚期糖基化終末產物受體（RAGE）信號通路、VEGF信號通路等。

2.3.4苦參治療結腸癌網絡圖使用Cytoscape軟件對檢索得到的苦參活性成分與潛在作用靶點進行分析，繪制網絡圖，運用“Network Analyzer”的功能進行拓撲分析，計算出不用節點的degree值，根據degree值篩選出苦參中的前五位活性成分為槲皮素、木犀草素、刺芒柄花素、苦參堿以及苦參素（見圖2）。

注：為苦參及其化合物；為潛在靶點；為通路

3 討論

有研究顯示，苦參堿活性成分對結腸癌具有干預作用，但具體的作用機制目前尙不清楚。為此我們以體外細胞試驗觀察苦參堿對人結腸癌細胞株HT-29增殖及蛋白表達的影響，并通過網絡數據庫分析苦參治療結腸癌的作用靶點與作用機制。本研究采用苦參堿干預人結腸癌HT29細胞株，發現苦參堿能夠抑制由IL-6引起的細胞增殖現象，并且隨著苦參堿藥物濃度的升高，腫瘤細胞生長活力受到明顯抑制，且與劑量呈現相關性。同時，檢測人結腸癌HT29細胞株p53蛋白表達情況，顯示與空白組比較，IL-6刺激HT-29細胞可引起p53蛋白表達水平下降，經不同濃度的苦參堿干預后p53蛋白表達水平增高，且呈現劑量依賴性。

根據網絡圖數據分析，苦參治療結腸癌的主要活性成分包括槲皮素、木犀草素、刺芒柄花素、苦參堿、苦參素。槲皮素最開始是從槲樹皮中提取出來的一種物質，屬于黃酮類化合物，在茶、核桃、紅酒以及各種水果、蔬菜中廣泛存在。體外細胞試驗發現，槲皮素對結腸癌細胞增殖、侵襲和轉移均有一定的抑制作用；槲皮素能影響B淋巴細胞瘤-2和Bax基因與蛋白的表達，而此二者與細胞凋亡有關［6］；還有研究發現槲皮素可以降低IL-6的信號轉導并降低轉錄激活因子3（STAT3）信號通路的活性，從而減少炎性因子的水平，使得腫瘤細胞的增殖受到影響，從而對機體起到一定的保護作用［7］。木犀草素也是一種天然廣泛存在的黃酮類化合物，同樣具有良好的抗腫瘤效果；依賴ATAD2蛋白［8］，木犀草素能夠有效抑制腫瘤細胞的增殖和轉移。臨床研究證實，苦參堿具有抗病毒、抗腫瘤、抗心律失常等藥理作用，可降低機體炎癥反應，抑制癌細胞的增殖和侵襲，具有較好的抗腫瘤作用［9］，鐘自強等［10］研究發現，苦參素能通過抑制 P-糖蛋白的表達以及提高細胞內藥物濃度來緩解結腸癌細胞的多藥耐藥性。還有研究發現，刺芒柄花素通過microRNA-149介導的EphB3下調和抑制磷酸酰肌醇-3-激酶/AKT和STAT3信號通路抑制結腸癌細胞生長和侵襲［11］。

根據PPI和網絡圖數據分析，苦參治療結腸癌潛在作用靶點為p53、AKT1、IL6、PTGS2等。p53是抑癌基因的一種，在基因組穩定、細胞周期停滯和其他重要的信號通路中發揮著重要的作用［12］。AKT1主要參與調節PBK/AKT/mTOR信號通路，AKT1異常激活后可促進腫瘤細胞的生長、繁殖，是癌癥治療中的理想靶位點［5］。有證據表明，結直腸癌發生和炎癥密切相關，炎細胞因子的過度分泌可以促進腫瘤的發展和轉移。炎癥因子IL-6與IL-6受體的結合會啟動細胞內信號傳導級聯反應，從而激活STAT3；而STAT3持續激活就會打破腫瘤細胞本身增殖與凋亡的平衡關系，使得腫瘤進一步惡化［13］。研究顯示，誘導型PTGS2與腫瘤細胞的增長繁殖、侵襲轉移等有關，對早期大腸癌患者選擇此靶點治療可取得顯著的臨床療效［5］。GO分析中，BP結果顯示苦參治療結腸癌的生物過程涉及細胞對非生物刺激的反應、蛋白質磷酸化的積極調節、T 細胞激活、上皮細胞增殖等，CC結果顯示主要涉及基底外側質膜、核被膜、囊泡腔等，MF結果顯示一氧化氮合成酶調節器活性、蛋白質激酶活性、生長因子受體結合等。KEGG分析結果顯示，苦參治療結腸癌主要涉及癌癥通路、晚期AGE-RAGE信號通路、VEGF信號通路等。其中癌癥通路是苦參治療結腸癌的主要通路［14］。研究表明AGE作為終末產物是一種非常穩定的共價化合物［15］；在細胞通路中，AGE通過其受體RAGE發出信號以激活NF-κB［16］，而NF-κB通路能調節促炎細胞因子的產生、白細胞募集或細胞存活，使機體產生炎癥反應［17］。

綜上所述，網絡藥理學方法發現苦參中的槲皮素、苦參堿、苦參素、木犀草素、刺芒柄花素等活性成分通過癌癥通路、AGE-RAGE信號通路等作用于IL6、AKT1、P53、PTGS2等靶點發揮腫瘤治療作用，此為苦參治療結腸癌提供了理論依據。

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Effects of Kushen （Sophora flavescens） on proliferation and p53 protein expression of human colon cancer based on network pharmacology

ZHANG Tianze，，，，，，，

1，，100029，

To observe the effects of matrine on proliferation and p53 protein expression in human colon cancer cell line HT-29， and to explore the therapeutic mechanism of Chinese medicine matrine on colon cancer.The human colon cancer cell line HT-29 was selected. After the cells were well cultured and grown， they were divided into the blank group （without any drugs）， the model group ［10 ng/mL of interleukin- 6 （IL-6）］， the 4 ng/mL matrine combination group （10 ng/mL of IL-6 combined with 4 ng/mL matrine）， and the 10 ng/mL matrine combination group （10 ng/mL of IL-6 combined with 10 ng/mL matrine）， respectively. Cell viability and p53 protein expression in each group were detected after a period of intervention. The main active ingredients of matrine and corresponding disease targets were obtained by searching Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP）， Online Mendelian Inheritance in Man （OMIM） and DisGeNET databases. Protein-protein interaction （PPI） was constructed from the potential targets of matrine on colon cancer using string database and Cytoscape software， and the common genes of drug disease were imported into the metasacpe data platform for Gene Ontology （GO） and Kyoto Encyclopedia of genes and genes （KEGG） enrichment analysis.Compared with the blank group， the cell viability was enhanced， and the protein expression level of p53 decreased in the model group. After treatment with matrine， the cell viability of each group significantly decreased， and the protein expression level of p53 increased. A total of 45 active ingredients and 22 potential action targets of Kushen were retrieved through a web search database， and the retrieved therapeutic pathways mainly included vascular endothelial growth factors （VEGFs）， cancer pathway， advanced glycation end products （AGE）-receptor for advanced glycation end products （RAGE） signaling pathway， and so on.Kushen can inhibit the proliferation of colon cancer cells and improve the expression of p53 protein； its mechanism may be that the anti-cancer active ingredients in Kushen act on p53， IL6， AKT1， PTGS2， and other targets through a variety of signaling pathways， thereby intervening in the colon cancer.

colon neoplasms； Kushen （Sophora flavescens）； cell proliferation； p53 protein； network pharmacology

10.3969/j.issn.1002-266X.2022.28.009

R735.3

A

1002-266X（2022）28-0038-05

通信作者:青島大學醫療集團科研專項（YLJT20212020）；山東省醫學會臨床科研專項（YXH2019ZX018）。

李克明（E-mail： lkm007@126.com）；張賀（E-mail： zhanghe1396@163.com）

（2022-07-19）