IRX5在原發性肝細胞癌患者血清中的表達及臨床意義

黃燕妮，李程程，許永劼，張競之，韋思佳，楊婷婷，黃昶煜東，張令，潘衛，，朱麗英

IRX5在原發性肝細胞癌患者血清中的表達及臨床意義

黃燕妮1，李程程2，許永劼1，張競之1，韋思佳1，楊婷婷1，黃昶煜東1，張令1，潘衛1，2，朱麗英1，3

1 貴州醫科大學醫學檢驗學院，貴陽 550004；2 貴州醫科大學附屬醫院產前診斷中心；3 貴州醫科大學附屬醫院臨床檢驗中心

探討原發性肝細胞癌（HCC）患者血清中易洛魁家族同源盒基因5（IRX5）的表達及臨床意義。收集117例HCC患者和52例肝臟良性疾病患者的血清樣本及相應臨床資料，以同時段46例健康體檢者的血清樣本作為對照組。采用酶聯免疫吸附試驗檢測各組血清IRX5表達，采用德國羅氏公司全自動化學發光免疫分析儀（Cobas e411）和西門子ADVIA2400全自動生化分析儀分別檢測血清甲胎蛋白（AFP）和丙氨酸氨基轉移酶（ALT）水平。比較各組血清IRX5、AFP和ALT水平差異，觀察不同臨床特征HCC患者的血清IRX5水平，分析HCC患者血清IRX5與ALT、AFP的相關性，評價血清IRX5對HCC的診斷效能。HCC組血清IRX5表達量高于肝臟良性疾病組及對照組（均<0.05），肝臟良性疾病組及對照組之間IRX5表達水平無統計學差異（>0.05）。HCC組血清IRX5表達量與血清AFP水平呈正相關（=0.27，<0.05），與血清ALT水平無關（=-0.082，>0.05）。IRX5和AFP診斷HCC的受試者工作特征曲線下面積分別為0.738（95%：0.667～0.808）、0.838（95%：0.781～0.895）；二者最佳臨界值分別為27.41、7.55 ng/mL，診斷HCC的敏感性分別為73%、77.4%，特異性分別為72.7%、79.5%。血清IRX5與AFP比較，診斷HCC的ROC曲線下面積、敏感性、特異性均無統計學差異（均>0.05）。IRX5在HCC中表達上調，其表達與血清AFP呈正相關，有望成為診斷HCC的候選標志物之一。

原發性肝細胞癌；易洛魁族同源盒基因5；甲胎蛋白；血清腫瘤標志物；丙氨酸氨基轉移酶

原發性肝癌（PHC）的主要臨床病理類型為肝細胞癌（HCC），患者多在晚期才出現典型臨床癥狀從而得以確診［2-3］，導致治療效果和預后較差［4］，病死率高［1］。因此，尋找早期診斷原發性肝癌的分子標志物對改善預后及提高生存率具有重要意義。易洛魁族同源盒基因（IRX）在人體生長發育發揮重要作用，主要調控早期胚胎的增殖與分化［5］。此外，也有研究證實IRX參與了腫瘤的發生發展［6］。IRX5基因是該家族中的重要成員之一，其編碼蛋白屬于核轉錄因子，具有高度保守性［7］。研究發現，在肝癌組織和肝癌細胞中IRX5表達量顯著增高，并且與肝癌細胞的增殖與遷移相關［8］。但目前未見將IRX5作為肝癌分子標志物的相關報道。因此本研究采用酶聯免疫吸附法檢測肝癌患者血清中IRX5的表達情況，并結合收集的臨床病理資料進行分析，探討IRX5作為肝癌潛在臨床血清分子標志物的可能性。

1 資料與方法

1.1臨床資料選取2018年7月—2019年3月初次就診貴州醫科大學附屬腫瘤醫院、病理明確診斷且臨床病例信息完整的HCC患者117例、肝臟良性疾病患者52例。HCC組117例中，男99例，女18例，年齡30～87歲，中位年齡 53歲；有病毒性肝炎病史76例，無病毒性肝炎病史41例；有肝硬化病史49例，無肝硬化病史68例；27例甲胎蛋白（AFP）<8.1 ng/mL，90例AFP≥8.1 ng/mL（AFP正常參考值為0～8.1 ng/mL）；30例丙氨酸氨基轉移酶（ALT）<40 U/L ，87例ALT≥40 U/L（ALT正常參考值為0～40 U/L）。肝臟良性疾病組52例中，男30例，女22例，年齡30～60歲，中位年齡 50歲。對照組選取同時段46例健康體檢者（既往無肝炎、肝硬化病史，無肝、腎、心功能不全及惡性腫瘤等疾病），男28例，女18例，年齡30～61歲，中位年齡 49歲。三組性別、年齡差異無統計學意義。本研究獲貴州醫科大學附屬醫院倫理委員會批準（批準文號：2018倫審第81號）。

1.2血清IRX5、ALT、AFP檢測收集被檢者血清進行分裝并保存于-80 ℃冰箱中待用。AFP和ALT分別采用德國羅氏公司全自動化學發光免疫分析儀（Cobas e411）和西門子ADVIA2400全自動生化分析儀檢測進行檢測。IRX5采用人IRX5 96T 酶聯免疫分析試劑盒進行檢測（批號：M1614277，上海酶聯生物科技有限公司），操作嚴格按照試劑盒說明書進行。首先設置標準品孔和空白孔，加適量相關反應酶，完成溫育、洗滌、顯色和終止等步驟，然后在450 mm波長依序測定各孔的吸光度。處理檢測數據，分別以標準品濃度和吸光度為橫坐標和縱坐標繪制濃度-吸光度標準曲線。按照上述檢測說明書設待測樣品孔，加入樣品稀釋液后再加待測樣品，測定樣品吸光度，測定步驟同上。根據標準曲線得出待測樣品中IRX5的濃度。

2 結果

2.1三組血清IRX5、ALT 、AFP水平比較三組間血清IRX5、ALT 、AFP水平比較均有統計學差異（均<0.05），HCC組血清IRX5、ALT、AFP水平均高于肝臟良性疾病組和對照組（均<0.05）。肝臟良性疾病組和對照組之間血清IRX5、ALT、AFP水平差異無統計學意義（均>0.05）。見表1。

表1　三組血清IRX5、ALT 、AFP水平比較（± s）

注：與肝臟良性疾病組、對照組比較，*<0.05

2.2HCC患者血清IRX5與ALT、AFP的相關性Pearson相關分析顯示，HCC患者血清IRX5水平與AFP水平呈正相關（=0.270<0.05），與ALT水平無關（=-0.082，>0.05）。

2.3不同臨床特征HCC患者的血清IRX5水平不同性別、年齡、有無病毒性肝炎病史、有無肝硬化病史、不同血清AFP 水平HCC患者血清IRX5水平差異均有統計學意義（均0.05）。見表2。

表2　不同臨床特征HCC患者的血清IRX5水平比較（ng/mL，± s）

2.4血清IRX5對HCC的診斷效能繪制血清IRX5、AFP診斷HCC的ROC曲線，IRX5、AFP診斷HCC的ROC曲線下面積（95%）分別為0.738（0.667～0.808）、0.838（0.781～0.895）；取血清IRX5最佳臨界值為27.41 ng/mL，診斷HCC的敏感性為73.0%、特異性為72.7%；取血清AFP最佳臨界值為7.55 ng/mL，其診斷HCC的敏感性為77.4%、特異性為79.5%；血清IRX5與AFP比較，二者診斷HCC的ROC曲線下面積、敏感性、特異性均無統計學差異（均>0.05）。

3 討論

IRX具有高度保守性，在早期胚胎的增殖與分化過程中扮演著重要角色［9］。在哺乳動物體內IRX1～IRX6共同組成易洛魁基因簇，其中IRX5位于16號染色體長臂12區2帶，外顯子區全長1452bp，且具有轉錄因子的活性［10］。BONNARD 等［11］采用純合子定位和位點重測序發現，轉錄因子IRX5同源異型結構域的突變能夠引起隱性先天性遺傳缺陷，可影響面部、腦、血液、心臟、骨骼和生殖腺發育。另有研究發現，Id2通過抑制前腸轉錄因子IRX5來決定腸道特性［12］。IRX5參與多種惡性腫瘤的發生發展，且與腫瘤的局部淋巴結轉移及遠處轉移相關［13］。IRX5參與Wilms腫瘤的發生、發展及其分化，可能發揮致癌的類似作用［14］。劉童等［15］發現在結直腸癌組織中IRX5 mRNA的表達水平上調，上調水平與癌癥的不良預后明顯相關。但IRX5在肝癌中的研究較少。本課題組前期研究顯示，IRX5在肝癌組織和肝癌細胞系中高表達，并且體內外實驗顯示其能促進肝癌細胞的增殖、侵襲與遷移［8］。本文研究結果顯示，HCC組血清IRX5表達水平明顯高于肝臟良性疾病組和對照組，為了探究HCC患者血清IRX5水平是否與臨床特征有關，本研究檢測了不同性別、年齡、有無病毒性肝炎病史、有無肝硬化病史及不同血清AFP 水平HCC患者的血清IRX5表達。結果顯示不同性別、年齡、有無病毒性肝炎病史、有無肝硬化病史、不同血清AFP 水平HCC患者血清IRX5水平差異均有統計學意義。劉童等［15］研究發現，IRX5在結直腸癌組織中的表達與年齡、性別、分化程度無關，但與腫瘤大小、區域淋巴結轉移和遠處轉移顯著相關。徐雯潔等［16］報道IRX5的表達與乳腺癌發生遠處轉移密切相關。本研究未來將納入HCC患者更詳細的臨床相關資料（如腫瘤大小、區域淋巴結轉移、遠處轉移等），進一步探究HCC患者血清IRX5水平與臨床特征的關系。

AFP有促進體外HCC細胞的增殖作用［17-19］，異位AFP表達能促進裸鼠HCC細胞的生長［20］，是臨床HCC診斷的首選血清學指標，具有高度敏感性。IRX5作為一個重要的轉錄因子，對腫瘤細胞的生長、侵襲、遷移和凋亡均發揮重要作用。本研究顯示，HCC患者中IRX5表達量顯著增高且與HCC血清標志物AFP表達量呈正相關，血清IRX5、AFP診斷HCC的ROC曲線下面積比較無統計學差異。目前，血清IRX5診斷肝癌的參考值還未見報道。本文117例HCC患者，取血清IRX5臨界值為27.41 ng/mL，診斷HCC的敏感性為73.0%、特異性為72.7%；取血清AFP臨界值為7.55 ng/mL，診斷HCC的敏感性為77.4%、特異性為79.5%。顯示IRX5與AFP對HCC有相似的診斷效能，提示IRX5可能有望成為診斷HCC的新型候選標志物。臨床血清AFP的正常參考值為0～8.1 ng/L。我們取血清AFP最佳臨界值為7.55 ng/mL觀察其診斷HCC的敏感性和特異性，只是針對本文117例患者的研究結果，可能存在部分偏差。ALT是評價患者肝功能損傷的重要指標之一，肝細胞的輕微損傷即可導致血清ALT水平顯著增高。本研究HCC患者血清IRX5表達與ALT表達無關，其原因推測可能單純肝臟損傷對血清IRX5水平影響不明顯，或者也與本研究樣本量過小有關，未來將加大樣本量對此問題繼續研究。

［1］ LESCURE C，ESTRADE F，PEDRONO M， et al.ALBI score is a strong predictor of toxicity following sirt for hepatocellular carcinoma［J］.Cancers （Basel），2021，13（15）：3794.

［2］ ZHOU Z，QI L，MO Q， et al.Effect of surgical margin on postoperative prognosis in patients with solitary hepatocellular carcinoma： A propensity score matching analysis［J］.J Cancer，2021，12（15）：4455-4462.

［3］ SUN X，LIU S，WANG J， et al.Annexin A5 regulates hepatocarcinoma malignancy via CRKI/II-DOCK180-RAC1 integrin and MEK-ERK pathways［J］.Cell Death Dis，2018，9（6）：637.

［4］ 劉虎，楊家和，吳孟超.原發性肝癌術后肺轉移的治療現狀［J］.中華轉移性腫瘤雜志，2019，2（4）：1-4.

［5］ BJUNE J I，HAUGEN C，GUDBRANDSEN O， et al.IRX5 regulates adipocyte amyloid precursor protein and mitochondrial respiration in obesity［J］.Int J Obes （Lond），2019，43（11）：2151-2162.

［6］ SUN X，JIANG X，WU J， et al.IRX5 prompts genomic instability in colorectal cancer cells［J］.J Cell Biochem，2020，121（11）：4680-4689.

［7］ HUANG L，SONG F，SUN H， et al.IRX5 promotes NF-κB signalling to increase proliferation， migration and invasion via OPN in tongue squamous cell carcinoma［J］.J Cell Mol Med，2018，22（8）：3899-3910.

［8］ ZHU L，LIU Y，CHEN Q， et al.Long-noncoding RNA colorectal neoplasia differentially expressed gene as a potential target to upregulate the expression of IRX5 by miR-136-5P to promote oncogenic properties in hepatocellular carcinoma［J］.Cell Physiol Biochem，2018，50（6）：2229-2248.

［9］ TAN Z，KONG M，WEN S， et al.IRX3 and IRX5 inhibit adipogenic differentiation of hypertrophic chondrocytes and promote osteogenesis［J］.J Bone Miner Res，2020，35（12）：2444-2457.

［10］ COSTANTINI D L，ARRUDA E P，AGARWAL P， et al.The homeodomain transcription factor IRX5 establishes the mouse cardiac ventricular repolarization gradient［J］.Cell，2005，123（2）：347-358.

［11］ BONNARD C，STROBL A C，SHBOUL M， et al.Mutations in IRX5 impair craniofacial development and germ cell migration via SDF1［J］.Nat Genet，2012，44（6）：709-713.

［12］ MORI K，NAKAMURA H，KUROOKA H， et al.Id2 determines intestinal identity through repression of the foregut transcription factor IRX5［J］.Mol Cell Biol，2018，38（9）： e00250-e00267.

［13］ ZHU Q，WU Y，YANG M， et al.IRX5 promotes colorectal cancer metastasis by negatively regulating the core components of the RHOA pathway［J］.Mol Carcinog，2019，58（11）：2065-2076.

［14］ HOLMQUIST MENGELBIER L，LINDELL-MUNTHER S，YASUI H， et al.The Iroquois homeobox proteins IRX3 and IRX5 have distinct roles in Wilms tumour development and human nephrogenesis［J］.J Pathol，2019，247（1）：86-98.

［15］ 劉童，張欣，王傳新.IRX5 mRNA在結直腸癌診斷及預后中的價值［J］.山東大學學報（醫學版），2016，54（7）：69-74，87.

［16］ 徐雯潔. IRX5通過上調YWHAB表達抑制乳腺癌細胞轉移的初步研究［D］ .淮北師范大學，2021.

［17］ DUDICH E，SEMENKOVA L，GORBATOVA E， et al.Growth-regulative activity of human alpha-fetoprotein for different types of tumor and normal cells［J］.Tumour Biol，1998，19（1）：30-40.

［18］ CHEN T，DAI X，DAI J， et al.AFP promotes HCC progression by suppressing the HuR-mediated Fas/FADD apoptotic pathway［J］.Cell Death Dis，2020，11（10）：822.

［19］ ?ZDEMIR F，BASKIRAN A.The importance of AFP in liver transplantation for HCC［J］.J Gastrointest Cancer，2020，51（4）：1127-1132.

［20］ PARPART S，ROESSLER S，DONG F， et al.Modulation of miR-29 expression by α-fetoprotein is linked to the hepatocellular carcinoma epigenome［J］.Hepatology，2014，60（3）：872-883.

Expression and clinical significance of IRX5 in serum of patients with primary hepatocellular carcinoma

1，，，，，，，，，

1，，550004，

To investigate the expression and clinical significance of iroquois family homeobox gene 5 （IRX5） in serum of patients with primary hepatocellular carcinoma （HCC）.Totally 117 serum samples with HCC （HCC group） and 52 serum samples with benign liver diseases （benign liver diseases group） were collected， and 46 serum samples from healthy subjects were used as the control group. Serum IRX5 expression was detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Serum alpha fetoprotein （AFP） and alanine aminotransferase （ALT） levels were detected by Roche automatic chemiluminescence immunoanalyzer （Cobas E411） and Siemens ADVIA2400 automatic biochemical analyzer， respectively. The levels of serum IRX5， AFP and ALT were compared among the groups， and the levels of serum IRX5 in HCC patients with different clinical characteristics were observed. The correlation between serum IRX5 ， ALT and AFP in HCC patients was analyzed， and the diagnostic efficacy of serum IRX5 in HCC patients was evaluated.The level of serum IRX5 was higher in the HCC group than in the benign liver disease group and control group （both<0.05）， and there was no significant difference in the level of IRX5 between benign liver disease group and control group （>0.05）. In the HCC group， serum IRX5 expression was positively correlated with serum AFP level （= 0.27，<0.05）， but was not related to serum ALT level （=-0.082，>0.05）. The area under receiver operating characteristic （ROC） curve of IRX5 and AFP in the diagnosis of HCC was 0.738 （95%： 0.677-0.808） and 0.838 （95%： 0.781-0.895）， respectively. The optimal cut-off values were 27.41 ng/mL and 7.55 ng/mL， respectively. The sensitivities in diagnosis of HCC were 73% and 77.4%， and and specificities were 72.7% and 79.5%， respectively. There were no significant differences in the area under the ROC curve， sensitivity， or specificity between serum IRX5 and AFP in the diagnosis of HCC （all>0.05）.The expression of IRX5 is up-regulated in HCC， and its expression is positively correlated with serum AFP， which is expected to be one of the candidate markers for the diagnosis of HCC.

primary hepatocellular carcinoma； iroquois homeobox gene 5； alpha fetoprotein； serum tumor markers； alanine aminotransferase

10.3969/j.issn.1002-266X.2022.28.002

R735.7

A

1002-266X（2022）28-0007-04

貴州省科技廳項目（黔科合基礎-ZK［2021］一般483，黔科合基礎-ZK［2021］一般366）；貴州省衛生健康委科學技術基金項目（gzwkj2021-360，gzwjkj2020-2-006）；貴州省教育廳青年科技人才成長項目（黔教合KY［2018］176）；貴州省高等學校大學生創新創業訓練計劃項目（20195200893）；貴州醫科大學附屬醫院博士啟動基金項目（I-2019-04）。

黃燕妮（1996-），女，初級檢驗技師，主要研究方向為肝癌發病機制。E-mail： 18311607475@139.com

朱麗英（1981-），女，副教授，主要研究方向為肝癌發病機制。E-mail： 179128466@qq.com

（2022-05-06）