天麻素經TLR4-NF-κB信號通路對帕金森大鼠的干預作用

李陽 邵宇

帕金森是臨床常見的神經內科疾病，作為一種神經退行性病變，患者大多具有運動遲緩、四肢震顫、步態障礙等表現，嚴重影響身體健康、生活質量[1,2]。老年人為帕金森主要發病群體，據不完全統計，近年來我國每年新增帕金森病例數居高不下，引起廣泛關注[3,4]。帕金森癥狀的發生發展受多種因素的共同作用，其具體發病機制尚未研究透徹[5]。目前西醫藥物治療為常用的治療帕金森的手段，但臨床療效并不十分理想，且會出現一些不良反應，并無一種特效的治療帕金森的藥物，因此中醫藥治療帕金森逐漸成為神經科醫生的重點研究方向[6,7]。本研究使用建立帕金森大鼠模式，并使用天麻素進行干預，觀察效果。

1 材料與方法

1.1 材料 選取50只SD健康雄性大鼠[湖南師范大學醫學院，許可證號：SYXK(湘)2019-0008]，年齡7～9周，平均(8.1±0.8)周；體重213～237 g，平均(225.1±9.6)g。所有大鼠于(22.9±2.7)℃環境中喂養。主要試劑：小鼠抗兔TLR4抗體(BD公司)；小鼠抗大鼠NF-κB p65抗體(Dako公司)；兔抗大鼠p38MAPK抗體(Gibco公司)；大鼠抗小鼠TNF-α(Sigma公司)；大鼠抗小鼠IL-1β、IL-6抗體(Hyclone公司)；兔抗大鼠Wnt3a抗體(Selleck公司)；小鼠抗兔β-catenin抗體(Invitrogen公司)。本研究獲取醫院倫理委員會批準。

1.2 建模及分組干預 隨機挑選10只為正常組，其余40只建立帕金森模型。建模方法：葵花油乳油溶解魚藤酮，濃度2 mg/ml，于大鼠頸背部皮下注射，1次/d，2 mg·kg-1·d-1，連續注射4周。大鼠出現肢體震顫、僵直、行動遲緩、步態不穩等現象即判定為建模成功。將建模失敗及建模過程中死亡大鼠剔除，最終建模成功35只。將35只帕金森大鼠隨機分為模型組8只及低、中、高劑量組各9只，正常組、模型組大鼠使用0.9%氯化鈉溶液進行灌胃處理，低、中、高劑量組大鼠分別使用0.2、0.4、0.6 g/kg天麻素注射液進行腹腔注射，1次/d。所有大鼠連續干預14 d。

1.3 檢測指標

1.3.1 學習、記憶能力檢測:學習能力檢測：將大鼠放入準備好的Y型迷宮內，5 min后進行電刺激，60 V電壓持續6 s，大鼠感受到電刺激后直接逃至無電刺激區域為正確反應，大鼠在無電刺激區域停留30 s后再次放入電刺激中，按此步驟反復訓練，連續訓練10次，其中9次符合正確反應標準為訓練合格，對比5組大鼠學習合格所用訓練次數。記憶能力檢測：Y型迷宮訓練結束后，次日再次進行Y型迷宮訓練，記錄5組大鼠10次訓練正確反應次數。

1.3.2 標本采集、HE染色:取5組大鼠腹部靜脈血3 ml,離心處理(離心半徑10 cm，轉速2 500 r/min，離心時間15 min)，-50℃保存。對大鼠進行麻醉處理后頸椎脫臼法處死，取海馬區腦組織，固定、完全浸泡在4%甲醛中，1 d后石蠟包埋、連續切片。切片脫蠟、脫水處理，蘇木素染色，之后進行分化、沖洗、乙醇梯度脫水處理，伊紅染色后再次進行乙醇梯度脫水，之后進行封片處理，顯微鏡下觀察，并記錄5組大鼠神經元數量。

1.3.3 Western blot法檢測TLR4/NF-κB通路、Wnt/β-catenin通路蛋白表達:取各組大鼠腦組織切片，添加裂解液提取蛋白50 μg，蛋白定量后進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜處理，室內環境封閉，3 h后1∶1 000添加一抗，4℃過夜孵育，次日取出后TBST清洗3次，之后1∶5 000添加二抗，室溫孵育2 h后TBST清洗3次，顯色、曝光、成像，檢測TLR4/NF-κB通路、Wnt/β-catenin通路蛋白表達。

1.3.4 酶聯免疫吸附實驗檢測炎性因子水平:標記酶標板，設置對照1、對照2、檢測孔3孔，終止液、顯色劑加入對照1孔，稀釋標準品加入對照2孔，血清標本、抗體加入檢測孔，封膜后震蕩均勻，使用37℃保溫箱培養1 h，之后去膜清洗，將水分吸干后添加顯色劑晃勻，顯色后添加終止液，450 nm處測吸光值，計算TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

2 結果

2.1 5組大鼠腦組織病理學觀察 正常組大鼠腦組織神經細胞形態正常，結構完好，分布緊密，無病理變化。模型組大鼠腦組織細胞形態各異，細胞核破裂，排列雜亂，出現明顯炎性細胞浸潤情況；低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠細胞形態改善，排列較為規則，炎性細胞浸潤情況緩解，其中高劑量組大鼠神經細胞形態基本正常，排列規則。見圖1。

圖1 5組大鼠腦組織病理學觀察(HE×200)

2.2 5組大鼠學習、記憶能力比較 與正常組比較，其他4組大鼠達標所需訓練次數較高、記憶成績較低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組大鼠達標所需訓練次數較低、記憶成績較高(P<0.05)；與低、中劑量組比較，高劑量組大鼠達標所需訓練次數較低、記憶成績較高(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠學習、記憶能力比較

2.3 5組大鼠兩側神經元數量比較 與正常組比較，其他4組大鼠兩側神經元數量較低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組大鼠兩側神經元數量較高(P<0.05)，且高劑量組大鼠兩側神經元數量高于低、中劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠兩側神經元數量比較 個

2.4 5組大鼠TLR4/NF-κB通路蛋白表達比較 與正常組比較，其他4組大鼠TLR4、NF-κB p65、p38MAPK表達較高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組TLR4、NF-κB p65、p38MAPK表達低于模型組，且高劑量組大鼠TLR4、NF-κB p65、p38MAPK表達低于低、中劑量組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 5組大鼠TLR4/NF-κB通路蛋白表達比較

2.5 5組大鼠炎性因子水平比較 與正常組比較，其他4組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平較高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平較低，且高劑量組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平低于低、中劑量組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 5組大鼠炎性因子水平比較

2.6 5組大鼠Wnt/β-catenin通路蛋白表達比較 與正常組比較，其他4組大鼠Wnt3a、β-catenin表達較高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組大鼠Wnt3a、β-catenin表達較低，且高劑量組大鼠Wnt3a、β-catenin表達低于低、中劑量組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 5組大鼠Wnt/β-catenin通路蛋白表達比較

3 討論

帕金森發病機制復雜性較高，有學者認為，環境、年齡、氧化應激、壓力、家族遺傳等均為危險因素[8]。臨床治療帕金森首選抗精神疾病藥物，但是尚無一種特效藥物能夠徹底治愈，并且有些藥物治療安全性欠佳，會誘發一些不良反應，甚至具有肝腎毒性，因此越來越多的專家學者通過基礎實驗研究中醫藥對帕金森的干預效果[9,10]。天麻素主要提取自天麻根塊部位，具有抑制血小板聚集、清除自由基、調節免疫等藥理作用[11,12]，有研究表明，天麻素具有神經保護作用，但是關于天麻素治療帕金森的效果及機制的研究還相對較少[13]。

大量臨床研究表明，帕金森的發生發展伴隨著機體神經功能、認知功能大幅減退[13,14]。有學者通過動物實驗研究帕金森大鼠學習記憶能力變化，認為帕金森大鼠學習記憶能力較差，干預之后能夠改善大鼠學習記憶能力，從而起到神經功能保護作用[15]。本研究設計Y型迷宮實驗，實驗發現，帕金森大鼠訓練達標所需次數較多、記憶成績較低，使用天麻素進行干預的大鼠達標所需次數下降，記憶成績提升，并且隨著天麻素劑量提升，效果更加明顯，說明帕金森大鼠神經功能出現損傷，學習記憶能力大幅下降，使用天麻素進行干預，帕金森大鼠學習記憶能力明顯提升，說明天麻素具有一定的神經保護作用，能夠減輕帕金森大鼠神經、認知功能損傷，并且其能力具有一定的劑量依賴性。本研究還對帕金森大鼠腦組織神經元數量進行檢測，發現帕金森大鼠神經元數量較低，使用天麻素干預的大鼠神經元數量上升，并且隨著天麻素劑量提升，神經元數量上升幅度更加明顯，進一步說明天麻素能夠發揮神經保護作用。

有研究表明，帕金森癥狀的發生發展與炎性反應具有密切聯系[16]。有研究表明，減輕腦組織炎性反應能夠使機體神經損傷嚴重程度減輕，起到神經保護作用，從而對帕金森癥狀起到干預效果[17]。TLR4/NF-κB通路為廣譜的炎癥通路，包括TLR4、NF-κB p65、p38MAPK等蛋白，其表達變化在機體炎性反應發生發展過程中發揮重要作用[18,19]。TNF-α、IL-1β、IL-6均為TLR4/NF-κB通路下游炎性因子，三者水平變化與機體炎性反應發生發展密切相關。本研究發現，帕金森大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65、p38MAPK相對表達量較高，使用天麻素進行干預后，TLR4、NF-κB p65、p38MAPK表達下調，TNF-α、IL-1β、IL-6水平下降，且天麻素劑量越高，TLR4、NF-κB p65、p38MAPK表達及TNF-α、IL-1β、IL-6水平下調幅度越大，說明帕金森大鼠腦組織出現一定程度炎性反應，使用天麻素進行干預，能夠調控TLR4/NF-κB通路蛋白表達，從而使下游炎性因子水平下降，減輕帕金森大鼠腦組織炎性反應，從而發揮神經保護作用。

有研究表明，帕金森患者認知障礙、神經功能損傷與機體腦組織神經元細胞凋亡具有密切聯系，緩解腦組織神經元細胞凋亡是緩解帕金森病情的關鍵[20]。Wnt/β-catenin通路蛋白表達變化與細胞凋亡具有密切聯系[21,22]。本研究顯示，帕金森患者Wnt3a、β-catenin表達較高，使用天麻素干預的大鼠Wnt3a、β-catenin表達下調，隨著天麻素應用劑量的提升，下調幅度更加明顯，說明使用天麻素進行干預能夠調控Wnt/β-catenin通路蛋白表達，從而抑制帕金森大鼠腦組織神經細胞凋亡，具有一定的腦保護作用。

綜上所述，使用天麻素對帕金森大鼠進行干預，具有一定神經元損傷修復作用，其機制可能與減輕帕金森大鼠腦組織炎性反應、調控細胞凋亡蛋白表達有關，為帕金森的臨床治療提供一定的理論依據。